一例猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪附红细胞体、猪链球菌混合感染的诊治和分析

2023年3月,河北省廊坊市固安县某猪场发生疫病,死亡率达50%。根据流行病学调查、临床症状及病理解剖观察,结合实验室染色图片镜检,核酸测序比对、荧光定量RCR检测分析,结果证实为一例猪繁殖与呼吸综合征病毒、附红细胞体、链球菌三种病原混合感染。随后采取合理的综合防治措施,并进行治疗。临床上混合感染病例较为常见,且极为严重,需凭借专业检验,深入分析诊断,才能有效避免疾病恶化,推动生猪健康成长,不断提升经济效益,推动行业有序发展。

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以-βactin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%。同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒。结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测。

基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒,猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型

为了建立一种可同时检测区分猪瘟病毒(CSFV),猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的寡核苷酸基因芯片方法,本研究针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针,检测低限为1.6×104PCV-2拷贝数/μL,1.6×104CSFV拷贝数/μL,1.6×105PRRSV拷贝数/μL,比琼脂糖凝胶灵敏约10倍。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测,检出了3种病毒的存在,其中25个样本(32.9%)同时感染了2种以上病毒。结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。

4株高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离与鉴定

2007年7月从江苏某些猪场采集的具有明显高热症状的病料组织中分离出4株病毒，经对病毒的TCID50测定、血清学试验、病毒基因鉴定，确认这4株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。病毒基因序列分析发现：4株病毒的NSP2基因均存在2处共30个氨基酸缺失，缺失氨基酸分别位于481位、532～560位。氨基酸序列同源性分析可见：分离株与VR2332株、MLV株的同源性很低，在60．3％至68．6％之间；与国内疫苗株CH-1a的同源性为83．1％～83．7％；与国内分离的变异株JXAI株、HUN4株、HB-1（sh）／2002株同源性很高，为91．2％～98．5％；同时4株分离株之间的同源性很高，为99．3％～100．0％。系统发育树表明：分离的4个毒株与JXAI毒株和HUN4株有较近的亲缘关系，与其他株的亲缘关系较远。动物回归试验表明，4株病毒均可以引起仔猪明显的临床高热症状。

猪caspase-1 p20多克隆抗体制备及其在猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染中的初步应用

为研究猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)在感染细胞中对半胱氨酸蛋白水解酶Ⅰ(caspase-1)的激活作用,本研究以PRRSV HuN4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)的cDNA为模板,构建caspase-1 p20蛋白的重组表达质粒,以表达的重组蛋白p20为抗原制备了兔抗猪p20的多克隆抗体。利用制备的多抗对PRRSV HuN4株(0.1 MOI)感染的PAM进行western blot检测,结果表明在PRRSV感染PAM 24 h后胞内caspase-1被大量诱导表达,同时caspase-1被水解激活并释放出p20。该研究结果为进一步阐明PRRSV感染细胞后引起IL-1β升高的分子机制研究奠定了基础。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒美洲株与猪Ⅱ型圆环病毒混合感染仔猪的血液病理学研究

选取3周龄左右早期断奶仔猪单独感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSVATCCVR-2332株）并与猪Ⅱ型圆环病毒（PCV2）人工共同按种，在不同时期取外周血，进行外周血常规生理指标和血液生化指标的检测，比较不同按种组中各指标的差异性。外周血淋巴细胞采用碘化丙啶（PI）单染色法染色，借助流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明，两病毒感染对外周血各种指标都有一定的影响，WBC、GPT、GOT、LDH、GLO及TBIL感染组高于对照组；RBC、HGB、PLT及ALB感染组低于对照组；PRRSV单独感染以及与PCV2在混合感染的变化规律基本相同，但混合感染多项指标的变化幅度更大；MCV及TP无明显差异；两病毒接种组外周血淋巴细胞的凋亡比率显著高于对照组，攻毒后2～3d达到高峰，此后逐渐下降并趋于恢复，混合感染组的凋亡比率又高于单独感染组。文章就这些病理现象的发生及影响进行了分析讨论。

我国南方猪高热病的研究(Ⅱ)——猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离、鉴定和致病性测定

从我国南方某猪场高热病死猪的组织中分离出能引起Mare145细胞病变的病毒，经过血清中和试验、RT-PCR测定，确定分离物中存在美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）。将细胞病毒液感染13头55—105日龄健康猪，另有3头健康猪用于同居感染。随意挑取13头中7头再用大肠杆菌培养物加强感染，感染后每天测温，观察临床症状，记录死亡情况和病理变化。结果表明：PRRSV单独感染猪6／6发病，5／6死亡；大肠杆菌与PRRSV混合感染猪7／7发病，5／7死亡；同居感染的3头全部发病，1头死亡。所有感染猪于感染后2—4d内均出现体温升高。两周后体温下降至正常，直到死亡前体温不再升高。死亡多集中在感染后的34—50d的2周时间内。将圈舍温度升至29℃对感染猪发病无加强作用。死亡猪的病理变化主要表现为严重的出血性、间质性肺炎，肢体远端皮表出血。结果表明，虽然PRRSV感染能够引起猪产生高热和高的发病死亡率，但从发病到死亡时间及某些病理变化上看，和南方猪场的发病死亡猪还存在一定的差异，这可能与猪场的一些激发因子或其他病原混合感染有关，从组织和细胞分离物的电子显微镜照片也证明了这一点。

高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染猪主要脏器的超微结构变化

对高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(HP-PRRSV)人工感染的成年猪脏器进行透射电子显微镜观察,结果发现,肺部组织细胞病变最严重,部分毛细血管破裂,毛细血管内皮细胞裂解,肺泡巨噬细胞线粒体嵴肿胀严重;脑部组织神经元细胞凋亡和胶质细胞坏死;肾脏和淋巴结组织中均出现病毒的复制和线粒体嵴的肿胀。该结果为阐明HP-PRRSV的致病机理提供了实验依据。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南09分离株ORF5基因的克隆及结构分析

参照GenBank上登录的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）美洲型AF494042株ORF5基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR扩增出PRRSV河南09分离株（HN-09）的ORF5基因,经与pGEM-T Easy载体连接后,筛选出阳性重组质粒进行序列测定,并利用DNASTAR软件对序列进行分析。结果表明,扩增片段长度为721 bp,与预期目的片段大小一致,测序验证其为PRRSV的ORF5基因。序列分析表明,HN-09株与AF494042的同源性为93.5%,与山西、山东近年分离株的同源性为97.8%-99.2%,与河北、安徽、黑龙江等省分离株的同源性为93.4%-98.7%,但与2004年河南分离株的亲缘关系较远,其同源性为88.7%。用ANTHEPROT软件分析HN-09株和AF494042株编码蛋白质氨基酸的组成和二级结构的含量及分布,结果表明,HN-09株中碱基的突变,导致其氨基酸序列与美洲型有所不同,形成的二级结构略有差异,但二级结构元件的大致分布与美洲型相同。

例猪圆环病毒2型、3型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒混合感染的诊断与防治

2024年5月,平顶山市某规模化猪场发生一起母猪流产、死胎,断奶仔猪咳嗽、气喘、高死亡率为特征的急性传染病。结合发病动物临床症状与病死猪剖检病变,采用荧光定量PCR方法对病料进行实验室诊断,确诊为猪圆环病毒2型、3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的混合感染。通过采取有效的防控措施,病情得到有效控制。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒M蛋白/N蛋白间与N蛋白/3'UTR引入重复序列的反向遗传操作

为获得一种经全长cDNA突变体拯救出的、随着传代次数的增多而最终致死的突变病毒,以嵌合感染性克隆p7AX12为骨架,分别在猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M蛋白与N蛋白间或(和)N蛋白/3'UTR之间插入32 nt,依次构建4个嵌合突变体pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R,经DNA转染Marc-145细胞后4个嵌合突变体均能拯救出病毒,且拯救病毒中的突变或插入的碱基具有遗传稳定性。突变病毒传代5次,没有最终致死的原因还有待于进一步研究分析。获得的4个突变病毒也为研制PRRSV基因标识疫苗及PRRSV复制转录机制研究奠定了基础。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的克隆与表达

用RT-PCR方法从河南分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)变异株(HN07-1)中扩增ORF5全长基因,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该序列与标准美洲株VR-2332同源性为89%,与我国早期分离的BJ-4株同源性为88%,与HB-1、JXAI变异株同源性为96%和99%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,成功表达了41.5 kD的融合蛋白。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测

为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。

ELISPOT检测高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染后猪γ-干扰素的分泌情况

目的:研究高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)感染后猪外周血单个核细胞(PBMC)特异性分泌γ-干扰素(IFN-γ)的免疫反应。方法:将仔猪接种PRRSV,于病毒接种前后各时间点分别采血并分离PBMC,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测PBMC分泌IFN-γ的情况。结果:猪感染高致病性PRRSV后,PBMC分泌IFN-γ的能力明显增强,对照组无明显变化。结论:该结果可为研究高致病性PRRSV致病机理提供参考,为评价PRRSV疫苗诱发的细胞免疫效应提供依据。

RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)

根据猪PRRSV的ORF7基因序列，设计并合成了1对引物，以PRRSV RNA为模板，筛选最佳反应条件，建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。应用该方法对病毒细胞培养物进行基因扩增，均获得了分子量为443bp的特异性目的片段，而对PCV2、PRV、CSFV及Marc-145细胞进行同条件检测，结果均为阴性；PRRSV扩增产物测序结果与文献报道的PRRSV其他毒株序列同源性达92％～98％。敏感性试验表明，该体系可检测到2．39TCID50的PRRSV；对2004-2005年送检的81份临床样品进行检测，阳性率为23．4％。上述研究结果表明，建立的RT—PCR特异性好、敏感性高，可用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和流行病学调查。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白编码基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增出大小为294bp的目的片段;再针对这个基因片段,设计合成4条寡核苷酸探针,其中反向引物的5′端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测,建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测,与RT-PCR检测方法相比,本方法具有良好的特异性和敏感性。试验结果表明用该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,对该病的进行快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒继发细菌感染病例的实验室诊断

猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一。实验采集临床疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征病死猪的脏器组织,应用分子生物学和细菌学方法进行实验室确诊。经荧光RT-PCR检测,该病例确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染所致;经细菌分离鉴定和耐药性分析,该病例继发革兰氏阳性球菌感染,头孢氨噻肟对该致病菌抑制效果较好。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的致病机理

猪繁殖与呼吸障碍综合征是目前危害我国养猪业最严重的传染病之一。本文就猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒致病机理方面的研究情况作一综述,为诊断技术、免疫机理的研究、疫苗设计和疫病防制提供借鉴。1感染猪发病机制PRRSV可以通过呼吸道、

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒Nsp2基因缺失株Jiangxi-3灭活疫苗免疫效果评价

将猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因缺失株Jiangxi-3的第9代病毒(Jiangxi-3F9)按常规方法制成油佐剂灭活疫苗,经肌肉注射免疫PRRSV和猪圆环病毒(PCV2)抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪,免疫组分别于初次免疫第21和28天、二次免疫第28天(即初次免疫第28天加强免疫1次)用200LD50的Jiangxi-3 F9进行攻毒,同时各组均设立对照组。通过试验动物体温变化、临床症状、血清PRRS抗体和抗原定期检测结果评价灭活疫苗的免疫效果。结果表明,初次免疫第21和28天免疫组攻毒后体温仍然明显升高,而二次免疫第28天免疫组攻毒后体温升高不明显,最高体温约40℃。初次免疫21-28 d免疫组特异性抗体水平持续升高,初次免疫第21天与第28天抗体水平差异显著(0.01<P<0.05);二次免疫后免疫组抗体水平仍持续升高,第28天可达3.105±0.125,二次免疫第28天与初次免疫28天抗体水平差异显著(0.01<P<0.05)。初次免疫第21天和第28天免疫组攻毒后仍能在血清中检出PRRSV抗原,仍表现不同程度的临床症状,而二免第28天的免疫组攻毒后其PRRSV抗原检出率、发病率、死亡率均为0。表明初次免疫第28天加强免疫一次比免疫一次效果好。