16SrDNA-RFLP分析繁茂膜海绵可培养放线菌的多样性

海绵是迄今为止已知海洋天然产物的最大来源。由于海绵的底栖过滤性摄食和消化选择性等生理特性,其体内蕴藏了丰富的微生物种群。近几年来,发现越来越多的海绵微生物产生很强的生物活性物质,有些并被证明是海绵天然产物的真正生产者。对大连海域繁茂膜海绵中的放线菌进行分离,对于得到的菌株进行16SrDNA扩增和RFLP及测序分析。研究表明海绵中蕴含着丰富的放线菌资源。其中包含链霉菌(Streptomycetes),拟诺卡氏菌(Nocardiopsis),假诺卡氏菌(Pseudonocardia),诺卡氏菌(Nocardia),小单孢菌(Micromonospora),红球菌(Rhodococcus),异壁放线菌(Actinoalloteichus)等属。利用限制性内切酶HhaⅠ对16SrDNA进行的RFLP分析能够对海绵中放线菌的16SrDNA多样性进行有效的分析,结果达到属,部分到种的级别。揭示了繁茂膜海绵中蕴藏着丰富的放线菌资源。

黄海繁茂膜海绵中微生物多样性的研究

构建了中国黄海繁茂膜海绵中细菌 16SrDNA克隆 ,对其遗传多样性进行了分析 ,发现海绵中相关细菌 16SrDNA基因主要归类于紫硫细菌门 (Proteobacteria)中的α_亚门、γ_亚门 ,和放线菌门 (Actinobacteria)等类群。所获得的16SrDNA序列与GenBank中的已知序列差异较大 ,反映出该海绵存在尚未发现的微生物新信息。

繁茂膜海绵原细胞形态学识别及分离纯化特点

利用透射电镜对繁茂膜海绵(Hymeniacdidon pelevis)的原细胞进行观察,确定其超微结构特点为:细胞核大,核仁显著。细胞质中富含线粒体和处于不同消化阶段的溶酶体。对繁茂膜海绵本体和芽体旺盛分生组织进行观察,发现原细胞在不同组织中形态多变。同时针对不同部位分别进行组织离散和原细胞富集,结果证明不同来源的富集原细胞团在原细胞比例和生长分化过程中都存在差异。

繁茂膜海绵清除大肠杆菌的过程

通过分析海绵清除大肠杆菌的过程,研究海绵净化细菌的机理。作者利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观测等手段,监测和分析了绿色荧光大肠杆菌(Escherichia coli)在繁茂膜海绵(Hymeniacidon perlevis)体内、体外水环境中数量变化过程。在1 L含有3×107个/m L绿色荧光大肠杆菌的海水中放入鲜重(1.02±0.11)g的繁茂膜海绵24块,处理7 h,海水中的荧光大肠杆菌数量逐渐降低;而海绵体内荧光大肠杆菌数量在2 h时内逐渐增多,之后的2 h趋于稳定,4 h以后开始逐渐减少。水体中大肠杆菌不仅进入海绵体内,而且进入海绵细胞内。含有荧光大肠杆菌的海绵块转入无菌海水中后,海绵体内及细胞中大肠杆菌逐渐消失,而且大肠杆菌没有被释放到环境海水中。分析表明,繁茂膜海绵能够以摄食的方式净化水环境中的大肠杆菌。

繁茂膜海绵中两株放线菌的生物学特性及其鉴定

从大连海域的繁茂膜海绵 (Hymeniacidonperleve)中分离到 5株具有抗菌活性的放线菌 ,它们分别对白色假丝酵母菌(Candidaalbicans)、枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)、稻瘟霉病菌 (Pyriculariaoryzae)等有良好的抑制作用。本文对其中 2株链霉菌的形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组分、1 6SrRNA序列进行了系统的研究 ,得到种水平的鉴定结果 :Hmp -S1 9为灰色链霉菌 (Streptomycesgriseus) ;Hmp -S2 6为生二素链霉菌 (Streptomycesambofaciens)。

繁茂膜海绵细胞内微生物多样性的研究

采用海绵组织离散、细胞分离的方法,对繁茂膜海绵细胞进行纯化、胞内微生物DNA提取,构建了繁茂膜海绵细胞内微生物的16SrDNA克隆,对其遗传多样性进行了分析,发现海绵细胞内微生物16SrDNA序列主要归类于紫硫细菌门(Proteobacteria)中的α-亚门、γ-亚门和浮霉菌门(Planctomycetes)等类群。与研磨直接提取海绵组织DNA所得海绵组织中总微生物多样性相比,海绵细胞内存在丰富的浮霉菌(23%),说明浮霉菌主要存在于海绵细胞胞内。

繁茂膜海绵滤除天然海水中病原细菌研究

近海水域的病原细菌污染问题日益突出,文章以广泛分布于北黄海、渤海的潮间带海绵—繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)为模式生物,通过检测海水中繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)过滤前后病原细菌的浓度的变化,考察了海绵滤除实际海水(黄海大连沿岸典型海域—东海头、老虎滩、付家庄)中病原细菌的动力学过程和机制,结果显示繁茂膜海绵能有效滤除不同地点的实际海水中的细菌,滤除大肠杆菌的效率最高,达到99%,滤除弧菌的效率在14.7%~48.9%(弧菌具有在海水中快速增殖的特征),滤除海水中细菌总数的效率为14.7%~41.6%。更关键的,海绵不但阻留而且消化天然海水中的大肠杆菌和弧菌。因此,海绵是生物修复近海水域病原细菌的理想生物。

繁茂膜海绵原细胞富集细胞团培养过程中的细胞迁移规律

海绵是重要的生物活性物质来源,近10年来,从海绵中发现的具有生物活性的新化合物占海洋生物来源的30%以上,并且大多具有显著的抗肿瘤,抗艾滋病病毒的活性。但是,由于海绵生物量不能满足这些活性物质进一步研究和商业化的需求,目前仅有一种活性物质被成功的商业化,这不仅是商业开发的损失,也是提高人类生活质量活动的一种损失。为了解决海绵供给不足的问题,人们进行了包括化学合成、海绵养殖以及海绵细胞培养在内的多种尝试,目前的研究结果表明,海绵细胞离体培养技术是最有可能彻底解决海绵供给不足的途径之一。但是由于海绵自身的特殊性,还没有人成功的建立起海绵细胞系以满足生产需要。人们发现,海绵细胞的相互接触对于离体海绵细胞长期培养至关重要。经过多年的探索,大连化物所海洋生物产品工程组建立了开发出了海绵原细胞富集细胞团培养技术,通过对海绵组织内的原细胞进行富集来获得可长期培养的海绵细胞。海绵原细胞是海绵组织内的"干细胞",具有很强的分化、增殖潜力,同时也是海绵组织内负责消化的主要细胞类型。为了探索海绵原细胞的增殖、分化规律,本研究基于海绵原细胞富集细胞团培养体系,构建了海绵细胞培养实时观测平台,对繁茂膜海绵原细胞、领细胞、上皮细胞3类主要海绵细胞类型在海绵细胞团形成及生长的全过程进行观察,了解不同类型细胞迁移规律的变化。通过对视频记录进行分析,发现离散的海绵细胞与细胞团内的海绵细胞具有截然相反的运动规律,海绵细胞的运动具有很强的协同性。伴随原细胞在细胞团内不停息的迁移,还观察到海绵细胞团内新生骨针的迁移以及细胞间进行颗粒物质的传递。这些信息的获得,将有助于进一步了解不同细胞的功能与作用,也有助于在此基础上探索海绵细胞的增殖、分化控制规律。

繁茂膜海绵对工厂化养鱼水体微生物净化作用的初步研究

在大菱鲆(Scophthalmus maximus)工厂化养殖废水中接种繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve),并将繁茂膜海绵与大菱鲆同池养殖,研究繁茂膜海绵对大菱鲆工厂化养鱼水体微生物的净化作用。结果表明,接种量为7 mg/L繁茂膜海绵经过8、16、24、32、40、48 h对养鱼废水中细菌总数的清除率分别为23.18%、47.65%、66.09%、81.57%、93.80%、98.96%;对弧菌的清除率分别为48.61%、56.44%、78.13%、92.88%、97.10%、98.56%;对大肠杆菌的清除率分别为39.51%、41.90%、73.24%、92.29%、97.69%、99.14%,将繁茂膜海绵以7 mg/L的生物量与大菱鲆同池养殖24 h,水体中细菌总数、弧菌和大肠杆菌的清除率分别为61.38%、50.34%、93.47%。

繁茂膜海绵中具有促进细胞粘附成团作用蛋白质的分离纯化研究

用凝胶层析和离子交换层析方法从黄海的繁茂膜海绵(Hymeniacidonperleve)中分离得到一种蛋白质D1,相对分子质量为2.3ku,pI为6.6。纯化的蛋白质富含疏水性氨基酸和酸性 氨基酸。研究表明蛋白质D1对繁茂膜海绵细胞培养表现出很强的使海绵细胞贴壁且快速粘附 成团的作用。凝集实验表明该蛋白对人的A、B、O、AB血,兔和鼠的红细胞没有凝集活性。

中国黄海海域繁茂膜海绵生长生殖周期的组织学特征

利用组织学和超微结构方法,对大连黄海海域的繁茂膜海绵(Hymeniacidonsp.)在自然海域的生长和生殖过程的组织学特征进行了近2a的观察。结果表明:繁茂膜海绵的生长呈现周期性变化,分为4个阶段:复苏期(3～5月)、生长旺盛期(6～8月)、衰退期(9～11月)和冬眠期(12月—次年2月)。繁茂膜海绵可以通过有性生殖进行繁殖,显著生殖期为8～10月,期间可以观察到卵细胞、精细胞囊、胚胎和幼虫。研究结果为深入研究繁茂膜海绵自然生长生殖特点,进而实现海绵组织块的继代培养和人工育种提供实验依据。

大气CO2浓度升高对繁茂膜海绵滤食海水细菌能力的影响

通过模拟大气CO_2浓度升高,研究其对海绵滤食细菌功能的影响。在模拟大气CO_2浓度升高生态系统中,探究了大气CO_2浓度387、500、750和1 000mmol/mol环境下繁茂膜海绵(Hymeniacidon perlevis)滤食灭菌海水中大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.1017)和灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的能力。结果表明:在24 h实验期间,模拟大气CO_2从目前约387mmol/mol升高至500mmol/mol,繁茂膜海绵滤食大肠杆菌和灿烂弧菌效率提高了。当模拟大气CO_2 750mmol/mol时,繁茂膜海绵滤食海水中大肠杆菌和灿烂弧菌功能都下降了,说明繁茂膜海绵已经受到大气较高浓度CO_2损害。模拟大气CO_2为1 000mmol/mol时,繁茂膜海绵基本丧失了滤食海水中大肠杆菌和灿烂弧菌的功能。上述结果可为了解大气CO_2浓度对近岸海洋生态系统的影响提供科学依据。

繁茂膜海绵中产甲壳素酶菌株筛选的研究

通过富集培养和初筛,从繁茂膜海绵中分离到108株产甲壳素酶菌株;其中有12株菌产生的透明圈比较明显。结合平板法和酶活力比较法,筛选出1株高酶活力的优良菌株H7,酶活力为0.54U/mL。通过16SrRNA同源序列分析和系统发育树分析,鉴定菌株H7为Pseudoalteromonas属,和P.ganghwensis\DQ011614相似性达到98%。

大气CO2浓度升高对繁茂膜海绵硅酶基因表达及胁迫后滤食新月菱形藻能力的影响

为探究大气CO2浓度升高对海洋硅质生物的影响,以繁茂膜海绵Hymeniacidon perlevis为模式生物,在实验室条件下模拟大气CO2浓度升高(500、750、1000 mg/L)对海绵硅酶基因相对表达的影响,以及胁迫48 h后在当前大气CO2(390 mg/L)下恢复1 h时海绵滤食新月菱形藻Natzchia closterum能力的变化。结果表明:500 mg/L大气CO2胁迫12、24、48 h时,海绵硅酶基因表达量分别比对照组(390 mg/L CO2)提高24.8%、14.8%、19.2%,而750、1000 mg/L大气CO2胁迫12、24、48 h时,海绵硅酶基因表达量分别比对照组降低40.0%、71.9%、82.3%(750 mg/L CO2),55.2%、83.6%、80.8%(1000 mg/L CO2);经高浓度大气CO2胁迫48 h再恢复1 h时,24 h内对照组海绵块滤食微藻的平均效率和平均清除率分别为198.2×104cells/(h·g)和4.09 mL/(h·g),而500、750、1000 mg/L大气CO2浓度组海绵滤食微藻的平均效率与平均清除率分别为对照组的104.8%、96.6%(500 mg/L CO2),58.5%、65.3%(750 mg/L CO2),30.8%、20.0%(1000 mg/L CO2)。研究表明,大气CO2浓度升高至750 mg/L以上时明显抑制了海绵硅酶基因表达,并导致海绵滤食微藻能力大幅下降。

共培养海绵微生物诱导抗菌活性物质的研究

从大连潮间带繁茂膜海绵中分离得到10株放线菌,对各菌进行抗枯草芽孢杆菌活性检测。结果显示:当各菌单独培养时,10株菌中有3株菌显示抗菌活性;当菌Hp-053与其余9株菌分别共培养时,9个共培养体系中5个显示出高于单培养的抗菌活性。进一步对部分共培养发酵液乙酸乙酯提取物进行薄层层析显色分析、生物自显影分析,证明共培养能诱导海绵相关微生物产生不同于单培养的代谢产物和抗菌活性物质。共培养可能是一条重新开发利用一些由于无活性或低活性而被忽视的海洋微生物菌种的新途径。

一株海绵放线菌的分离鉴定及活性研究

从大连潮间带繁茂膜海绵中分离到一株具有很强抑制革兰氏阳性菌活性和较强抗肿瘤活性的链霉菌。通过其形态观察 ,生理生化测定和 1 6SrDNA序列的测定 ,初步判定属于假浅灰链霉菌 (Streptomycespseudogriseolus)。并对其活性物质的生产条件进行了初步探索和优化 ,确定了用天然海水配制的TSB培养基为最佳发酵培养基 ,3d为最适发酵时间。

抗稻瘟病菌的海绵放线菌Hmp-S14的生物学特性及其鉴定

从大连海域的繁茂膜海绵(Hymeniacidonperleve)中分离到一株具有抗稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)活性的放线菌Hmp-S14菌株 ,对分离菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组分、16SrDNA序列进行了系统的研究。在系统发育树中 ,Hmp-S14菌株与Streptomycessetonii在同一分支中 ,二者序列相似性为98% ,结合形态、生理生化和细胞壁化学组分分析结果 ,将其鉴定为Streptomycessetonii。

海绵细菌B25W的鉴定及其活性物质的初步研究

分离自繁茂膜海绵(Hymeniacidonperleve)的细菌B25W经16SrRNA序列分析,鉴定为解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillusamyloliquefaciens)。解淀粉类芽孢杆菌产生的生物活性物质对植物和人类的致病真菌葡萄孢菌(Botrytisfuckeliana)、镰刀菌(Fusariumsolani)、紫青霉(Penicillumpurpurogenum)、稻瘟霉(Piriculariaoryzae)、白念珠菌(Candidaalbicans)有很好的拮抗作用,是一种对热和酸稳定的水溶性物质。

我国2种习见海绵的生物特性与培养应用研究进展

近年来海绵特殊的生物结构和生理功能日益受到海洋生物研究领域的关注,关于海绵在生物制药、海洋微生物培养、水质净化、生物仿生等方面的开发价值与应用前景更是研究热点。繁茂膜海绵和肾指海绵是我国黄海海域潮间带广泛分布的海绵生物种群,每年春、夏季在近海集中出现,种群数量增殖速度很快,具有较为广阔的研究利用前景。该文对近年来国内外关于繁茂膜海绵和肾指海绵生物特性的研究进行了比较总结,重点阐述了这2种海绵的人工培养和应用研究的最新进展。

产杀虫抗菌单端孢霉烯族毒素海绵真菌Myrothecium verrucaria Hmp-F73的筛选和鉴定

从98株分离自大连海域繁茂膜海绵Hymeniacidon perleve共附生的真菌中,筛选得到具有较强杀虫抗菌活性的丝状真菌Hmp-F73。96孔板卤虫生物检测(brine shrimp assay,BSA)结果显示,该菌株发酵滤液甲醇提取物浓度为0.25μg.mL-1时,卤虫校正死亡率为100%;甲醇提取物经硅胶柱层析洗脱得到7个馏分,其中馏分3浓度为400μg.mL-1时对甜菜夜蛾具明显抑制取食活性,拒食率达到85.25%;1mg.mL-1的馏分6对玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani抑菌圈直径达9.25mm。经色谱柱层析分离纯化得到4个杀虫抗菌活性化合物,氢核磁数据显示这些化合物均属于12,13-环氧单端孢霉烯族化合物。通过形态、培养特征及ITS1-5.8S-ITS2序列分析,将该菌株鉴定为疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria。