Rhodococcus sp.R04细胞色素P450单加氧酶及CYP125A18与唑类药物的互作分析

红球菌(Rhodococcus sp.)R04基因组有15种细胞色素P450单加氧酶,其中CYP125A18与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和马红球菌(Rhodococcus equi)的CYP125有较高同源性。利用NCBI蛋白质数据库搜索同源序列,对Rhodococcus sp.R04的15种CYP450一级结构序列进行比对和系统发育分析;对CYP125A18基因进行了克隆表达,并用紫外分光光度法对蛋白质的光谱学特性以及与唑类药物互作情况进行分析。实验结果表明,Rhodococcus sp.R04 15种CYP450均含有保守的氨基酸序列和铁血红素催化中心。SDS-PAGE分析表明,CYP125A18分子量约为50 k D,CYP125A18还原态和CO结合后与CYP125A18氧化态的差示光谱表现为典型的CYP450光谱特性。CYP125A18与底物4-胆甾烯-3-酮结合后,血红素铁全部转变为高自旋状态;与唑类药物滴定后发生了II型光谱转变。解离常数表明,7种唑类药物与CYP125A18的亲和力由强到弱依次为酮康唑、益康唑、4-苯基咪唑、氟康唑、4-甲基-2-苯基咪唑、克霉唑、甲硝唑。上述发现对研究CYP125代谢胆固醇具有重要意义,同时为疾病耐药性研究及药物选择提供数据和理论支持。

Rhodococcus sp. Ns对硝基苯酚的好氧生物降解

通过驯化富集培养,从红树林底泥中分离出6株硝基苯酚降解菌,其中Rhodococcussp.Ns为对硝基苯酚(PNP)与邻硝基苯酚(ONP)的高效降解菌.在好氧条件下该菌可以耐受小于1.8 mmol/L的PNP,能够利用PNP和ONP为唯一碳源、能源和氮源生长并将其完全矿化.研究了Rhodococcussp.Ns在不同pH、盐度与浓度范围下,PNP的降解特性并探讨了该菌降解PNP的途径.实验得出该菌在盐度<5‰、pH>5的条件下能较快生长,1.5 mmol/L的PNP在96h内被完全降解,并检测到至少2种中间产物4-硝基儿茶酚(4-nitrocatechol)和1,2,4-苯三酚(1,2,4-benzenetriol).红树林底泥中固有的细菌对PNP和ONP具有高效降解作用.

红球菌-R04生物降解多卤代联苯的影响因素研究

研究了不同取代元素以及取代元素的数量、位置等因素对Rhodococcus sp.R04降解多卤代联苯的影响.结果表明,联苯苯环第4位上的氢分别被氟、氯、溴以及甲基基团取代后降解率由高到低依次为4-FB>4-CB≥4-MB>4-BrB;当取代元素相同时,随着取代原子数目的增加,多卤代联苯降解率降低;当取代元素及取代原子数目相同时,不同位置的取代对卤代联苯的降解影响较大,特别是2,6位取代会强烈抑制关键酶对卤代联苯的催化降解,导致降解率降低.

苯酚降解菌红球菌(Rhodococcus sp.)P1的鉴定及其在焦化废水中的应用

【目的】酚类物质的去除是焦化废水处理的关键问题,目的是从焦化废水中分离高效的苯酚降解细菌。【方法】以苯酚为唯一碳源筛选纯化降解苯酚细菌,菌株鉴定采用菌落形态和16S rRNA序列分析方法,并研究其苯酚降解特性和在焦化废水中的除酚作用。【结果】菌落形态和16S rRNA序列比对分析表明分离的P1菌株为红球菌属(Rhodococcus sp.)细菌;其耐酚浓度高达1400 mg/L,苯酚降解的最适条件为32℃-42℃、pH 7.0和0-4%盐;苯酚降解动力学曲线符合Haldane动力学模型,q max=0.517/h,K s=77.487 mg/L,K i=709.965 mg/L;不同重金属对红球菌P1菌株的苯酚降解抑制作用不同,Zn2+、Mn2+和低浓度的Pb2+对菌株降酚没有影响,Cu2+、Ni2+、Cd2+均抑制菌株对酚的降解;红球菌P1菌株2 d内可完全降解1/3焦化原水中的279.9 mg/L酚类物质。【结论】P1菌株是1株高效的苯酚降解菌,具有生物处理焦化废水酚类物质的潜力。

红球菌R04苯甲酸转运相关膜蛋白RHOGL009301的生理功能

【目的】探究红球菌(Rhodococcus sp.)R04膜蛋白RHOGL009301的生理功能和突变菌株的代谢特性,确定该膜蛋白的生理功能与苯甲酸转运的关系。【方法】将RHOGL009301基因与绿色荧光蛋白基因在Rhodococcus erythropolis进行融合表达,Delta Vision观察该基因蛋白产物的定位。通过基因同源重组敲除RHOGL009301基因,并对比野生型菌株和缺陷型菌株在不同碳源培养下的生长情况。HPLC测定红球菌R04野生型菌株和缺陷型菌株代谢联苯和苯甲酸时细胞内外代谢物,分析不同生长条件下代谢物的浓度变化。【结果】RHOGL009301基因与绿色荧光蛋白基因在Rhodococcus erythropolis中实现共表达,并定位在细胞膜上。获得了RHOGL009301基因的缺陷型菌株R04ΔMP,与野生型菌株相比,缺陷型菌株在联苯和苯甲酸培养条件下的生物量明显降低,生长速度减慢。HPLC分析表明RHOGL009301基因的缺失抑制了苯甲酸的转运。【结论】膜蛋白RHOGL009301是苯甲酸代谢和转运相关的蛋白,基于序列同源性分析,该膜蛋白是一种新型的苯甲酸转运蛋白。

红球菌R04联苯/多氯联苯代谢相关调控蛋白RHOGL007659的生理功能

【目的】研究红球菌(Rhodococcus sp.)R04调控蛋白RHOGL007659的生理功能及其缺陷菌株的代谢特性,初步探究红球菌R04降解联苯的调控机制。【方法】通过基因同源重组敲除红球菌R04联苯代谢相关基因RHOGL007659。比较红球菌R04(野生型)和缺陷型菌株R04Δ7659(基因RHOGL007659缺陷型的R04)在不同碳源培养下的生长情况,HPLC分析R04和R04Δ7659转化联苯的能力。提取R04和R04Δ7659的总RNA,实时荧光定量PCR检测联苯降解关键基因的转录表达。纯化Bph B(联苯降解脱氢酶)和Bph D(联苯降解水解酶),制备多克隆抗体。Western blot分析Bph B和Bph D蛋白在R04和R04Δ7659中的表达水平。【结果】获得了RHOGL007659基因的缺陷型菌株R04Δ7659,与R04相比,R04Δ7659在联苯培养条件下的生物量趋近于零。HPLC分析表明,RHOGL007659基因的缺失使红球菌R04丧失转化联苯的能力。实时荧光定量PCR结果表明,在联苯培养条件下,缺失RHOGL007659后的R04,其联苯降解关键基因均有不同程度的下调表达。Western blot分析显示RHOGL007659缺失后,联苯降解关键酶Bph B和Bph D表达量均降低,这与实时荧光定量PCR结果相一致。【结论】RHOGL007659是红球菌R04联苯降解关键基因簇的调控蛋白,该蛋白对红球菌R04代谢联苯过程具有正调控作用。

红球菌R04细胞的不对称分裂及其在联苯胁迫下的分裂抑制

【目的】研究红球菌R04细胞的分裂方式及联苯对其形态和细胞分裂的影响。【方法】以一株多氯联苯降解菌株(Rhodococcus sp.R04)为研究对象,利用荧光显微镜、扫描电子显微镜及透射电子显微镜分析红球菌R04在不同培养条件下的细胞分裂。【结果】红球菌R04细胞表现出对称分裂(约占30%)和不对称分裂(约占70%)两种分裂方式,且培养条件不影响不对称分裂细胞所占的比例。细胞分裂过程中,隔膜主要分布于细胞长度的30%–50%。在联苯的分解代谢过程中,红球菌R04细胞的生长分裂会受到联苯的抑制,但不影响红球菌R04细胞的分裂方式,在联苯胁迫下,细胞形成丝状化,表现出异常分裂,随着培养时间的延长,在细胞生长指数后期至转换期,细胞能够进行正常分裂。【结论】环境异生型化合物联苯/多氯联苯对其降解菌株——红球菌R04细胞的生长和分裂有较强影响,但是并不影响其分裂方式。

石油脱硫微生物的筛选及特性研究

从泰安某加油站采集土壤样品,筛选到一株可以专一性降解二苯并噻吩(DBT)的菌株,经常规和生理生化鉴定判断为红球菌属(Rhodococcus sp.),命名为YY-5。对DBT的降解产物经分析为二羟基联苯(2-HBP)、二苯并噻砜(DBTO2)和硫酸根离子,完全符合"4S"途径。产物用gibb’s试剂结合分光光度计测试,测算出菌株的脱硫能力。脱硫试验表明,DBT浓度对菌株的脱硫能力也有影响,DBT浓度过高,会抑制菌株的脱硫能力。一般在54 h左右YY-5的酶活性开始降低,在80 h左右完成脱硫。在以正十二烷、正十六烷、液体石蜡、萘和柴油为碳源的培养基中生长不旺盛,不能利用上述烃类作唯一碳源和能源。说明YY-5在脱硫过程中不会明显降低燃油的燃烧值。另外试验也表明,有机氮对菌的脱硫活性有抑制作用。

联苯代谢对微生物的生长胁迫及分裂抑制

以联苯/多氯联苯降解菌株R04(Rhodococcus sp.R04)和几种模式微生物为研究对象,利用高效液相色谱、荧光显微镜、扫描电子显微镜等分析微生物在联苯及其代谢物培养条件下细胞分裂和形态的变化.结果表明联苯及其代谢产物对红球菌R04和几种模式微生物细胞的分裂有抑制作用,并对部分微生物形态有影响.与前体-联苯及其代谢产物2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸相比,2,3-二羟基联苯对G^+、G^-细菌,或是酵母细胞分裂都有较强的抑制和形态的改变.2,3-二羟基联苯导致R.R04和缺陷型R.R04细胞形成不完整隔膜的比例增加;造成96.4%的大肠杆菌BL21细胞表面凹陷,胞质内容物流失,菌体体积缩小;导致枯草芽孢杆菌89.6%的细胞体积明显缩小;导致金黄色葡萄球菌基本没有细胞能形成完整的分裂隔膜;导致红酵母细胞能进行出芽生殖的比例从64.2%降低到19.3%,但对其细胞形态无明显改变.联苯代谢物2,3-二羟基联苯对红球菌R04及其它微生物细胞分裂和增殖的抑制作用比其前体-联苯强,建议在研究环境化合物与微生物互作时,应考虑环境化合物代谢的毒性效应.

N端缺失的锰过氧化氢酶生理生化特性

【目的】在红球菌(Rhodococcus sp.)R04中发现了一种高表达,N端缺失的锰过氧化氢酶(Mn-CAT),为了明确其在活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除与多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)代谢中所起的作用,本文对其生理生化特性进行了研究。【方法】利用DNAMAN对Rhodococcus sp.R04与Rhodococcus sp.R1101Mn-CAT的核酸和蛋白序列进行比对。化学合成和PCR搭桥法获取Mn-CAT全长基因。分别构建了原核表达载体p ETm3c-Mn-CAT,p ETm3c-Mn CAT-C,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,得到重组菌p ETm3c-Mn-CAT/BL21,p ETm3c-Mn CAT-C/BL21。工程菌诱导表达后,粗酶液经Q-sepharose和硫铵沉淀进行纯化。构建了锰过氧化氢酶C端(Mn CAT-C)基因的敲除载体p K18mobsac B-ΔMn CAT-C,电击法转入Rhodococcus sp.R04。荧光极化测定ROS的含量,HPLC分析多氯联苯的降解率。【结果】与Rhodococcus sp.R1101Mn-CAT基因序列相比,Rhodococcus sp.R04Mn-CAT缺少N端(R1101的Mn-CAT序列长度为915bp,R04的Mn CAT-C序列长度为468bp)。获得了纯度较高的Mn CAT-C,SDS-PAGE分析表明分子量约为23 k Da。以H2O2为底物时,Mn CAT-CKm比Mn-CATKm大,约为0.02357mol/L。通过基因同源重组的方式,得到菌株R04的Mn CAT-C敲除菌株,与野生菌株相比,敲除菌株体内ROS浓度显著增高,生长速率和多氯联苯降解速率明显下降。【结论】发现了一种N端缺失的锰过氧化氢酶,该酶具有原酶的大部分活性,且可以清除体内的ROS。Mn CAT-C基因的缺失影响了菌株的生长速率和多氯联苯的降解速率。