EDAG-1的原核表达及单克隆抗体的制备

目的构建红系发育相关基因(erythoid develop associated gene,EDAG-1)原核表达系统并制备其单克隆抗体,以进一步研究 EDAG-1调控细胞增殖、分化及凋亡的分子机制,探讨其临床应用前景。方法本实验选用 pGEX-4T-3载体,构建含 GST 标签的 pGEX-4T-3-EDAG-1原核表达载体,经过对表达体系进行优化,IPTG 诱导,获得较高效率的 GST-EDAG-1融合蛋白表达,纯化该蛋白,对 BALB/C 小鼠进行免疫。将免疫后小鼠的脾脏细胞和来源于同种系小鼠的 SP2/0骨髓瘤细胞(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型和胸腺核苷激酶缺陷型)采用 PEG 介导的融合方式进行细胞融合实验,通过 HAT 培养基对融合细胞进行初步筛选,进而通过 ELISA 实验对所获得杂交瘤细胞进行抗体表达验证。结果成功构建了含 GST 标签的pGEX-4T-3-EDAG-1原核表达载体,并表达出较高纯度的 EDAG-1蛋白,获得表达 EDAG-1抗体的单克隆杂交瘤细胞。通过对单克隆抗体的初步实验表明,所获单克隆抗体具有很好的特异性,较低的背景和较好的稳定性。结论通过原核表达途径制备 EDAG-1单克隆抗体是可行的,所获单克隆抗体具有很好的特异性,较低的背景和较好的稳定性。