跨膜丝氨酸蛋白酶2-成红细胞特异性转化基因相关基因、成红细胞特异性转化基因变异体1及成红细胞特异性转化基因变异体4在前列腺癌中的表达及临床意义

目的分析跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)-成红细胞特异性转化基因相关基因(ERG)、TMPRSS2-成红细胞特异性转化基因变异体1(ETV1)、TMPRSS2-成红细胞特异性转化基因变异体4(ETV4)在前列腺癌中的表达及临床意义。方法2018年4月至2020年9月我院收治的82例前列腺癌患者,采用免疫组化法检测癌组织及癌旁正常组织中TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4表达。分析上述因子表达与前列腺癌临床病理特征的关系及诊断前列腺癌的价值。结果前列腺癌组织中TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4阳性表达率均高于癌旁正常组织(P<0.05)。临床分期C+D、Gleason评分≥5分者TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4阳性表达率高于临床分期A+B、Gleason评分<5分(P<0.05)。RTMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4联合检测曲线下面积(AUC)、敏感度、特异度分别为0.814、0.925、0.865,均高于各项指标单独检测(P<0.05)。结论TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4在前列腺癌患者中呈过度表达,通过联合检测上述因子对前列腺癌的诊断与鉴别诊断有良好的应用价值。

高效的红细胞特异性表达系统的建立和优化

目的探讨慢病毒载体中红细胞特异性基因调控元件的优化对小鼠红白血病(murine erythroleu-kemia,MEL)细胞向红系终端分化期间组织特异性表达重组蛋白的影响。方法改变红细胞特异性β-珠蛋白启动子编码长度、改变β-珠蛋白基因位点控制区DNaseⅠ高敏位点(hypersensitive site,HS)的组合、删除β-珠蛋白3'端增强子或β-珠蛋白内含子IVS2,由此构建一系列由不同缺失组合的基因调控元件控制目的基因(如人凝血因子Ⅸ)表达的慢病毒载体,包装成重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染小鼠MEL细胞。用O6-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,BG)-卡莫司汀[1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,BCNU]联合筛选以富集感染的阳性细胞,用酶联免疫吸附测定方法检测目的基因的表达,评估不同基因调控元件组合对重组慢病毒载体所携带的目的基因表达的影响。结果经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的慢病毒载体结构正确;三质粒系统瞬时转染人肾胚胎293T细胞包装的重组自灭活慢病毒可通过长时间高速离心有效浓缩;用50μmol/L BG-50μmol/L BCNU联合筛选可有效富集感染的阳性细胞;经环六亚甲基双乙酰胺(N,N'-hexamethyle-nebisacetamide,HMBA)诱导第8天的106个小鼠MEL细胞中表达的重组人凝血因子Ⅸ平均质量浓度达到正常水平的3.8%(191 ng/ml)。结论通过适当减少调控元件优化慢病毒载体不仅有助于提高携带的外源基因片段长度、增加载体制备的有效性、实现温和提高目的基因产物达到治疗水平需求量的目的,而且为开展以红细胞特异性表达载体介导的携带蛋白类药物的红细胞治疗以及非血液病基因治疗奠定临床前的研究基础。

建立携带左旋天门冬酰胺酶的红细胞特异性表达系统

目的:建立基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶(L-ASNase)的体系。方法:采用2A联体技术将L-ASNase和红色单体荧光蛋白基因分别置于红细胞特异性基因调控元件或非组织特异性短延长因子1α启动子控制下,构建慢病毒载体,分别包装成组织特异性重组慢病毒或非组织特异性重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染靶细胞,用六氧苄基鸟嘌呤/卡莫司汀联合筛选以富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;用六亚甲基二乙酰胺诱导富集的阳性细胞向红细胞分化,流式细胞术检测红色单体荧光蛋白报告基因的表达,荧光显微术观察基因表达产物在细胞中的定位,免疫印迹分析L-ASNase的表达水平,评估在红细胞分化过程中组织特异性重组慢病毒的表达优势。结果:经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的重组慢病毒载体结构正确;免疫荧光结果显示在非组织特异性慢病毒感染的HeLa细胞中,L-ASNase主要表达在细胞质,单体红色荧光蛋白主要表达在细胞核内,提示2A序列通过自裂解使同一读框中的2个基因获得了表达;用50μmol/L六氧苄基鸟嘌呤-50μmol/L卡莫司汀联合筛选,可有效富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;经六亚甲基二乙酰胺诱导,第7 d的MEL细胞中表达的重组L-ASNase浓度达0.3 U/mg总蛋白。结论:红细胞特异性慢病毒载体可以在小鼠红白血病细胞向红细胞分化过程中使携带基因的表达逐步增高,优于非组织特异性慢病毒载体。本研究为基因修饰造血干细胞、并通过体外细胞分化的方法大量产生携带L-ASNase的红细胞治疗恶性血液病奠定了临床前的实验基础。

ABO反定型试剂红细胞配制方法的探讨

目的摸索ABO反定型试剂红细胞的配制方法。方法配制20%的洗涤红细胞悬液后放置4±2℃冰箱保存,每周混匀后取样进行红细胞抗原性及特异性测定和反定型试验(微板法)检测凝集能力实验,观察细胞凝集状态,并记录结果。结果自配反定型试剂保存期为35d。在配制后第35天,自配红细胞与相应的抗血清的特异性凝集反应仍有>2+S的凝集强度,具有良好抗原稳定性;与不对应的抗血清均无凝集反应,具有良好的特异性;用自配红细胞做反定型试验,特异性凝集能被酶标仪测出,符合实验要求。结论运用自配反定型试剂,操作简便,原料易得,成本低廉,制成的红细胞具有良好的免疫特异性、抗原稳定性和凝集效能,符合实验要求。

红细胞转化特异性转录因子相关基因的生物信息学研究

目的利用生物信息学方法分析人红细胞转化特异性转录因子（ETS）相关基因（ERG）以及蛋白的结构，为进一步研究其功能和参与的调控机制提供理论依据。方法通过GenBank搜索ERG基因序列（NM_001136154）及蛋白序列（NP_001230357），采用生物信息学方法分析该基因在不同物种中的差异，分析该蛋白的亚细胞定位、二级结构、功能域以及相互作用蛋白。结果该基因编码一个长度为468个氨基酸的蛋白质，具有2个PNT和ETS两个功能域。ERG蛋白理论相对分子质量为53837．51，理论等电点为7．29。二级结构中α螺旋（H）占比12．35％，β折叠（E）占比3．50％，无规卷曲占比84．16％。ERG蛋白含有4个可能的N连接糖基化位点，11个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，5个豆蔻酰基化位点，7个蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。并进一步利用STRING分析了该蛋白的相互作用网络。结论利用生物信息学预测出的结构和功能信息，为ERG的相关研究提供一定的信息基础。

子宫内膜癌C-erbB-2、ETS1和p53的表达及临床意义

目的:探讨子宫内膜癌组织中C-erbB-2、成红细胞特异性转化因子1(ETS1)及p53表达及临床意义。方法:选择2019年1月至2020年12月我院收治的疑似子宫内膜癌患者90例作为研究对象,所有入选者均检测C-erbB-2、ETS1及p53阳性情况。以病理检查结果作为“金标准”,分析C-erbB-2、ETS1及p53诊断子宫内膜癌的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值,并计算各指标单项以及联合诊断结果与病理检查结果的一致性。结果:90例疑似子宫内膜癌患者经病理结果确诊52例为子宫内膜癌,38例为良性病变;C-erbB-2、ETS1及p53联合诊断的灵敏度94.23%(49/52)、特异度94.74%(36/38)、准确度94.44%(85/90)、阳性预测值96.08%(49/51)、阴性预测值92.31%(36/339)均高于各项指标单独检测,差异有统计学意义(P<0.05)。C-erbB-2诊断结果与病理检查结果一致性较差(Kappa=0.312,P<0.05),ETS1诊断结果与病理检查结果一致性理想(Kappa=0.297,P<0.05),p53诊断结果与病理检查结果一致性理想(Kappa=0.323,P<0.05),联合诊断结果与病理检查结果一致性极好(Kappa=887,P<0.05)。结论:C-erbB-2、ETS1及p53的异常表达能够反映子宫内膜癌患者病情变化,联合检测在早期诊断中准确度、灵敏度、特异度均较高,与病理检查结果一致性极好,在临床有较高的应用价值。

C-erbB-2、ETS1和p53在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义

目的:观察C-erbB-2、成红细胞特异性转化因子1(ETS1)和p53在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义。方法:选取90例子宫内膜癌患者手术病理组织标本为研究对象,将其设为研究组,另选取同期90例正常子宫内膜标本为对照组。比较两组ETS1、C-erbB-2、p53阳性表达率,及其与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系。结果:研究组ETS1、C-erbB-2和p53阳性表达率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。国际妇产科联盟(FIGO)分期为Ⅲ~Ⅳ期子宫内膜癌ETS1、C-erbB-2和p53阳性表达率均高于FIGO分期为Ⅰ~Ⅱ期子宫内膜癌;低分化子宫内膜癌ETS1、C-erbB-2和p53阳性表达率均高于中高分化子宫内膜癌;淋巴结转移子宫内膜癌ETS1、C-erbB-2和p53阳性表达率均高于无淋巴结转移子宫内膜癌;且ETS1、C-erbB-2和p53阳性表达率随肌层浸润增加而升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:ETS1、C-erbB-2和p53在子宫内膜癌组织中的表达与子宫内膜癌的发生密切相关,其阳性表达率与临床分期高、分化程度低、肌层浸润深和有淋巴结转移可能有关。

荧光原位杂交技术检测融合基因对前列腺癌的诊断价值

目的：探讨荧光原位杂交技术（ FISH）检测跨膜丝氨酸蛋白酶2基因（ TMPRSS2）和成红细胞特异性转化基因（ETS）家族[ETS相关基因（ERG）、ETS变异体1（ETV1）及ETS变异体4（ETV4）]的融合基因对前列腺癌的诊断价值。方法收集前列腺癌44例及良性前列腺疾病20例的病理标本，应用3组FISH探针分别检测TMPRSS2/ERG、TMPRSS2/ETV1及TMPRSS2/ETV4融合基因，并与病理诊断结果比较。结果前列腺癌组患者TMPRSS2/ERG、TMPRSS2/ETV1、TMPRSS2/ETV4融合基因阳性率分别为59．1％、9．1％、2．3％，总体阳性率为70．5％（31/44）。与病理诊断相比，FISH诊断前列腺癌敏感度为70．5％（31/44），特异度为100．0％（20/20）。前列腺特异性抗原（PSA）＜10 ng/ml、PSA 10～20 ng/ml、PSA＞20 ng/ml患者TMPRSS2/ERG探针阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。 TMPRSS2/ERG 融合基因阳性与血清PSA 水平无明显相关性（P ＞0．05）。结论 FISH 检测TMPRSS2/ETS（ ERG、ETV1、ETV4）融合基因诊断前列腺癌具有较高价值。