中药体外抗红色毛癣菌效应研究

目的 筛选体外抗红色毛癣菌效应较强的中药并探究其主要功效物质。方法 对26味药材进行体外抗红色毛癣菌效应研究,采用HPLC-Q/TOF-MS/MS法对丁香、蛇床子、百部、大黄、土荆皮、苦参进行分析,对主要成分进行药效验证。结果 苦参和土荆对红色毛癣菌抑制效果最好,MIC值为64μg/mL。油镜观察显示该6味药材对红色毛癣菌菌丝的细胞壁均有不同程度的破坏作用。欧前胡素、蛇床子素、土荆皮乙酸和苦参酮对红色毛癣菌有抑菌效果,MIC值为16μg/mL。结论 苦参、土荆皮、大黄、丁香、蛇床子和百部对红色毛癣菌抑制效果最好,其药效物质为苦参酮、土荆皮乙酸、欧前胡素、蛇床子素、丁香酚、乙酰基丁香酚。

侧柏叶抗红色毛癣菌主要活性成分α-蒎烯以ERG-3为靶点发挥抗真菌作用

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)是皮肤癣最主要病原;侧柏叶(Cacumen Platycladi)是侧柏[Platycladus orientali s(L.)Franco]的干燥嫩枝梢及叶,被《苗族医学》收录用于治疗皮肤癣。本研究旨在探讨侧柏叶抗T.rubrum的主要活性物质及其抗真菌机制,为抗皮肤癣新药研发提供帮助。本研究通过测定最小抑菌浓度和孢子萌发率分析了侧柏叶活性物质对T.rubrum的抑菌活性,使用电镜观察T.rubrum菌丝形态和孢子超微结构,并检测侧柏叶活性物质对T.rubrum细胞膜通透性、完整性和麦角甾醇含量的影响,从而阐述侧柏叶活性物质对T.rubrum抑菌机理,最后采用GC-MS和qRT-PCR方法找到其抗T.rubrum的作用靶点。结果显示,侧柏叶石油醚部位的α-蒎烯为主要抗菌活性成分,MIC为32μg·mL^(-1),极显著抑制孢子萌发(P<0.01);α-蒎烯可致细胞膜发生明显损伤和内容物流出、通透性极显著增加(P<0.01)以及24 h内细胞膜中麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇含量显著下降(P<0.05);引起脂质色谱图中ERG3活性抑制相关的“麦角甾烷-7,24-二烯-3β-醇”色谱峰出现;可极显著降低ERG3的相对表达量(P<0.01)。结果表明,α-蒎烯是侧柏叶中发挥抗T.rubrum活性最主要成分且以ERG3为其抗真菌靶点。

牛尾独活叶抗红色毛癣菌活性成分研究

为了解牛尾独活叶的抗红色毛癣菌活性,以抑菌圈大小为考察指标,对比了牛尾独活不同部位、其它独活品种和常见的抗红色毛癣菌植物之间的差异,通过单因素试验和响应面法优化牛尾独活叶提取工艺,并对牛尾独活叶提取液进行溶剂萃取和化学成分预试分析。研究结果表明:伞形科不同属植物的抗红色毛癣菌活性具有差异性,牛尾独活具有较好的抑菌活性,其叶、种子、茎和根的抑菌活性差异不大。牛尾独活叶最佳抗红色毛癣菌活性的提取工艺为:乙醇体积分数25%、液料比15∶1(mL∶g)、超声波功率220 W、提取温度80℃、提取时间30 min,在此工艺条件下,牛尾独活叶提取液对红色毛癣菌的抑菌圈为(22±0.2)mm;牛尾独活叶提取液中抑菌成分均能较好地溶解在石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中,其中,石油醚萃取液抑菌效果最好;化学成分预试显示牛尾独活叶具有抗红色毛癣菌的活性成分可能是多酚类和黄酮类化合物。

盐酸小檗碱联合抗真菌药物对红色毛癣菌的体外药敏实验

目的观察盐酸小檗碱联合不同浓度抗真菌药物对红色毛癣菌的体外抗菌活性。方法参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)颁布的M38-A2方案和相关文献对临床分离的30株红色毛癣菌进行体外药敏实验。其中盐酸小檗碱的MIC值定义为与生长对照相比,肉眼观察出现80%生长抑制的最低药物浓度。采用分数抑菌浓度(FIC)评定两药联合效果。FIC≤0.5,两药为协同作用;0.5<FIC≤4,两药为无关作用;FIC>4,两药为拮抗作用。结果盐酸小檗碱和不同浓度伊曲康唑联合,主要为无关作用。盐酸小檗碱和不同浓度特比奈芬、伏立康唑联合,均为拮抗作用。16.0μg/mL氟康唑组与盐酸小檗碱联合时FIC≤0.5所占比例为83.33%,协同作用最强;2.0～8.0μg/mL卡泊芬净组与盐酸小檗碱联合时,FIC≤0.5所占比例最高,均为63.33%,协同作用最强,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论盐酸小檗碱与高浓度氟康唑、卡泊芬净联合,体外对红色毛癣菌有较强的协同作用。

土槿皮对红色毛癣菌的抑菌作用及其超微结构的研究

采用药基混合法和液体稀释法对红色毛癣菌进行敏感性实验;观察药物作用下红色毛癣菌的超微结构变化.结果发现土槿皮水提物对红色毛癣菌菌丝有明显的抑制作用,抑菌效果与浓度呈正相关;最小抑菌浓度(MIC)为1 mg/mL;透射电镜观察到药物作用下红色毛癣菌菌丝细胞壁明显增厚,细胞质及细胞器内部物质被降解,出现空腔,残留不规则膜结构.认为土槿皮对红色毛癣菌有强烈的抑制作用,有代替抗生素治疗皮肤癣症的应用潜力.

红色毛癣菌对人角质形成细胞模式识别受体TLR-2,TLR-4,Dectin-1表达及细胞因子分泌的影响

目的研究红色毛癣菌对人角质形成细胞模式识别受体TLR-2,TLR-4,Dectin-1表达及细胞因子分泌的影响,探讨角质形成细胞对红色毛癣菌的免疫应答及其机制。方法红色毛癣菌孢子与人永生化表皮细胞株HaCaT细胞共培养,采用Real time PCR检测共培养后HaCaT细胞TLR-2,TLR-4,Dectin-1mRNA的表达情况;采用流式细胞技术检测共培养后不同时间段HaCaT细胞TLR-2,TLR-4及Dectin-1平均荧光强度;采用蛋白芯片抗体阵列检测共培养上清液中36种不同的细胞因子,趋化因子和急性时相蛋白的表达情况。结果共培养6 h后,TLR-2,TLR-4,Dectin-1mRNA表达上调;共培养量明24显h增后加TL。R结-2,论T L人R角-4,质D形ec成tin细-1胞平对均红荧色光毛强癣度菌增的高免,细疫胞识因别子和I应L-答8,,I在-30一9,定IF程N-度γ,上IL可-6通,IL过-1上3调在红Ha色Ca毛T癣细菌胞刺中激模后式分识泌别受体TLR-2,TLR-4及Dectin-1后分泌多种细胞因子来实现。

红色毛癣菌感染豚鼠模型的构建

目的构建红色毛癣菌感染豚鼠的动物模型。方法自临床标本选取3个红色毛癣菌菌株,经糖皮质激素预处理及接种后追加应用的方法,促进红色毛癣菌感染动物模型建立;采用直接镜检、真菌培养和组织病理方法验证感染结果。结果在应用适当剂量糖皮质激素干预下,红色毛癣菌动物接种后10d左右,直接镜检、真菌培养和组织病理均显示感染成功。结论糖皮质激素干预下可建立稳定的红色毛癣菌感染豚鼠的动物模型。

盐酸小檗碱对红色毛癣菌形态学的影响

目的观察红色毛癣菌在盐酸小檗碱作用下形态学变化。方法应用美国CLSI制订的标准M38-A方案,采用MTT微量稀释法测定盐酸小檗碱对红色毛癣菌的体外抑制率。将盐酸小檗碱作用前后的红色毛癣菌制成标本,分别在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察形态学变化。结果盐酸小檗碱作用于红色毛癣菌后,扫描电子显微镜下菌丝表面变粗糙,菌丝萎缩、皱瘪、粗细不一,出现多处破损、断裂和小的破坏性孔洞。透射电子显微镜下细胞变形,呈不规则形;细胞壁粗糙,厚薄不均;细胞浆结构模糊,细胞核凝固、破碎。结论盐酸小檗碱使红色毛癣菌的形态发生明显变化。

苎麻织物对红色毛癣菌和须癣毛癣菌的抑制作用

目的通过分析苎麻织物对红色毛癣菌和须癣毛癣菌生长的影响,探讨苎麻织物对常见皮肤癣菌的抑制作用。方法实验采用改良的烧瓶振荡法和奎因法。前者是将苎麻坯布分别与红色毛癣菌和须癣毛癣菌混合振荡培养,对照组为棉坯布组,3 d后分别取培养液稀释5倍后涂布培养皿,计算各自的菌落数和抑菌率并进行统计分析。后者是将2种真菌分别接种在苎麻坯布上,培养60 h后与对照组比较菌落生长情况。结果改良烧瓶振荡法结果显示苎麻织物组抑菌率明显高于对照组(P<0.05),苎麻织物对红色毛癣菌、须癣毛癣菌的抑菌率分别为40%和37%;改良奎因法显示苎麻织物组2种真菌的菌团明显小于对照组。结论苎麻织物可抑制红色毛癣菌和须癣毛癣菌的生长。

传代对红色毛癣菌表型和核糖体基因影响的研究

目的通过对传代前后红色毛癣菌表型和核糖体基因的分析,探讨传代对表型变异和核糖体基因的影响。方法采用传统方法鉴定原代及传代后的5株红色毛癣菌临床菌株及1株标准菌株;对原代及20代的菌株核糖体保守区(5.8S和ITS2)和非转录间隔区(NTS)进行PCR扩增和基因测序,比较原代与传代后表型及核糖体基因有无变化。结果红色毛癣菌菌株在传代过程中发生多次表型变异,且变异可逆转。同一菌株的原代与20代PCR扩增指纹图一致,基因序列亦基本一致,其中20代标准株菌株在TRS-1区可见个别碱基的突变。结论红色毛癣菌传代过程中表型极易发生变异和逆转,而核糖体基因相对稳定。

红色毛癣菌致皮下脓肿型Majocchi肉芽肿

目的:报告1例红色毛癣菌引起的皮下脓肿型Majocchi肉芽肿,并对国内报道的类似病例进行文献回顾。方法:对患者的临床资料、真菌学检查、分子生物学鉴定、组织病理及疗效进行分析,并对1998—2012年国内报道的16例红色毛癣菌肉芽肿进行分析比较。结果:患者为女性,23岁。患有特发性血小板减少性紫癜,长期应用糖皮质激素,左小腿出现结节、脓肿及溃疡4个月。溃疡表面分泌物真菌镜检菌丝阳性,真菌培养及分子生物学鉴定为红色毛癣菌。皮损组织病理可见真皮深层及皮下组织大片坏死,有较多中性粒细胞和少量多核巨噬细胞浸润,PAS染色可见菌丝。诊断为:红色毛癣菌皮下脓肿型Majocchi肉芽肿。伊曲康唑治疗3个月皮疹消退留有瘢痕,随访3个月无复发。文献回顾发现,红色毛癣菌肉芽肿病程长,大部分患者免疫功能正常,皮损多为结节、斑块,出现皮下脓肿较少见。应用伊曲康唑或特比萘芬治疗一般均有较好治疗效果。结论:红色毛癣菌致皮下脓肿型Majocchi肉芽肿较少见,及时足量应用伊曲康唑治疗,疗效确切。

红色毛癣菌的生物学特性研究

目的 观察红色毛癣菌在不同温度、不同培养基上的生长和产孢情况,并对其进行分子生物学鉴定.方法 ①大培养:采用沙堡葡萄糖琼脂(SDA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平皿,27℃、35℃黑暗培养,测量菌落直径,绘成生长曲线.②小培养(钢圈法):采用SDA、PDA、溴甲酚紫乳固体葡萄糖琼脂(BCP-MSG)、乳蜜琼脂(M)和复合维生素B(VitB)培养基,27℃、30℃黑暗培养,观察镜下菌丝生长、孢子产生情况.③进行rDNA 18S和ITS序列测定.结果 在SDA,PDA上,27℃条件下菌落生长速度较35℃快;在5种培养基上,SDA、PDA产孢较快较多,复合维生素B培养基产孢较慢,但产生大分生孢子较多.30℃产孢更丰富.对部分菌株rDNA ITS、18S PCR扩增产物纯化后直接测序,结果在GenBank中比对、分析,相似度为98%～100%,均鉴定为红色毛癣菌.结论 SDA、PDA均为鉴定和分离红色毛癣菌的合适培养基.5种培养基均可用来刺激红色毛癣菌产孢,其中SDA、PDA产孢较早、较丰富.红色毛癣菌rDNA 18S和ITS序列测定是一种快速准确的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法.

高效液相色谱法分析红色毛癣菌麦角甾醇的含量

采用反相高效液相色谱法，建立了测定红色毛癣菌中麦角甾醇含量的方法。样品经过皂化、提取后定量测定。用Waters symmetry shieldTM RP C18色谱柱（4．6mm×150mm，5μm），流动相为100％甲醇，流速为1．0mL／min，检测波长为282nm，保留时间定性，外标法定量。麦角甾醇的保留时间为8．9min。麦角甾醇在0．93—29．75mg／L浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，相关系数分别为0．9998。添加回收率实验表明，麦角甾醇的平均添加回收率为94．8％～96．3％；相对标准偏差为1．8％-3．3％；麦角甾醇的最低检出浓度为0．008mg／L。本方法准确、简便、重现性好，可用于真菌中麦角甾醇的含量测定。

伊曲康唑治愈红色毛癣菌肉芽肿1例

伊曲康唑治愈红色毛癣菌肉芽肿１例王爱平，王端礼，李若瑜，周祖德，万喆我们应用伊曲康唑胶囊２００ｍｇ／天治愈１例红色毛癣菌肉芽肿，现报告如下。患者女性，２ｌ岁，待业，安徽人。因右腰部皮肤反复红斑鳞屑性损害２年余，局部皮肤肿物进行性增大１０个月，破溃流脓...

红色毛癣菌致慢性复发性泛发型浅部真菌病的临床分析

目的慢性复发性泛发型浅部真菌病患者较少见。文中探讨红色毛癣菌所致的慢性复发性泛发型浅部真菌病的原因及诊疗方法。方法收集南京军区南京总医院2012年6月至2014年6月就诊的5例红色毛癣菌所致的慢性复发性泛发型体癣患者,取患者皮损进行真菌镜检及培养,对其中1例典型患者(病程7年,趾甲严重累及、皮疹全身泛发)的皮损进行组织病理学检查,对其不同部位皮损处分离的4株菌株行微生物学及分子生物学研究,并根据体外药敏试验进行药物选择。结果患者皮损处真菌学检查见大量有隔分枝的菌丝,培养及分子生物学鉴定为红色毛癣菌。不同皮损处菌株基因型鉴定为同一菌株。组织病理示鳞状上皮轻度增生,表面角化过度,真皮浅层血管周围少量淋巴细胞浸润。PAS染色表皮见少量有隔菌丝。确诊后给予口服伊曲康唑,外用特比萘芬乳膏,酮康唑洗剂洗浴等综合治疗取得良好效果。结论慢性复发性泛发型浅部真菌病,对病原菌的分离鉴定尤为重要,且应注意患者有无指/趾甲的累及,治疗不能仅针对体癣治疗,而应结合药敏试验采取综合治疗。

MALDI-TOF MS自建库在红色毛癣菌感染中的临床快速诊断价值

目的建立并评价实验室自建的红色毛癣菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)数据库的可行性。方法将红色毛癣菌标准菌株ATCC 28188用沙保罗葡萄糖琼脂(SDA)平板28℃培养5d,分别用双甲酸夹心法和甲酸提取法作为蛋白提取方法,利用MALDI-TOF MS对标准菌株进行质谱数据采集,建立2种不同蛋白提取方法的菌株数据库"双甲酸夹心法自建库"和"甲酸提取法自建库";并用2种蛋白提取方法对21株红色毛癣菌临床分离株进行蛋白提取后,分别选取"双甲酸夹心法自建库+Bruker商品库"、"甲酸提取法自建库+Bruker商品库"和"Bruker商品库"做质谱鉴定,从而对各数据库的鉴定效果进行评价。结果"甲酸提取法自建库+Bruker商品库"对21株红色毛癣菌临床分离株的鉴定得分显著高于其余两组,差异有统计学意义(P<0.05),匹配率为21/21;"Bruker商品数据库"与"Bruker商品数据库+双甲酸夹心法自建库"的鉴定得分比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验室建立的"甲酸提取法自建库+Bruker库"对红色毛癣菌的鉴定能力好,适用于临床微生物实验室。与待测菌统一培养条件所建立的数据库丰富了原有的数据库信息,使待测菌的鉴定更为准确。双甲酸夹心法操作简便,但对红色毛癣菌蛋白提取的效果欠佳。

ROS在长脉冲1064nm激光体外照射红色毛癣菌中的表达及作用

目的探讨活性氧簇(ROS)在长脉冲1 064 nm激光体外照射临床分离的红色毛癣菌Y和红色毛癣菌N中的表达变化及其作用。方法应用长脉冲Nd:YAG 1 064 nm激光分别以200 J/cm2,400 J/cm2、600 J/cm2能量照射红色毛癣菌Y菌落(分离自临床激光治疗有效的病甲)和红色毛癣菌N菌落(分离自临床激光治疗无效的病甲),未行激光照射组为对照组,观察红色毛癣菌Y和N的菌落在激光照射第1、3、5、7天的生长曲线变化,同时应用比色法检测ROS(H2O2、OH-、O2-)表达水平。结果红色毛癣菌Y随着激光照射能量的增加,生长曲线下移,在激光照射能量为600 J/cm2时,菌落停止生长,其ROS表达水平随照射剂量的增加而升高;红色毛癣菌N随着激光照射能量的增加,各激光能量组生长曲线接近重合,菌落生长不受影响,其ROS表达水平随照射剂量的增加无明显变化。结论 ROS可能在长脉冲1 064 nm激光治疗红色毛癣菌甲真菌病中发挥了作用。

家庭内红色毛癣菌病患者间菌株差异性分析

目的用PCR技术比较分离自同一家庭红色毛癣菌病患者的菌株差异性,分析家庭内多发的红色毛癣菌病的致病菌株是家内相互感染,还是家外感染。方法以家庭内多发的皮肤癣菌病患者为研究对象,分离致病菌株并以传统方法鉴定菌种。再分别用随机扩增多态性DNA(RAPD)和巢式PCR特异扩增红色毛癣菌的串联重复亚元件(TRSS:TRS-1/TRS-2)产生的指纹图谱分析种内株间有无差异性。结果纳入实验的16株菌分离自8个家庭,用形态学等方法及种特异引物均鉴定为红色毛癣菌。RAPD显示4个家庭内的菌株间有差异性,TRS-1区PCR指纹图谱显示5个家庭内菌株有株间差异,TRS-2区能鉴定出2个家庭内菌株间有差异。综合各方法共区分出6个家庭内的菌株间有带型差异。结论该研究提示家庭内多发红色毛癣菌病从家外途径感染率高于家内感染。TRS-1区PCR指纹图谱对红色毛癣菌的菌株区分度高于RAPD,更适于红色毛癣菌株间分型。结合多种分子分型方法可最大限度发现不同菌株间的差异。

用微小卫星引物PCR鉴定红色毛癣菌和须癣毛癣菌

目的 :观察红色毛癣菌和须癣毛癣菌临床分离株 DNA PCR指纹的差异 ,找出一种区分红色毛癣菌和须癣毛癣菌的基因分类方法。 方法 :采用寡核苷酸重复序列 (GACA ) 4、(GTG) 5 及 M13中心序列 (5′- GAGGGTGGCGGTTCT- 3′) 3种引物 ,对 2 3株红色毛癣菌和 11株须癣毛癣菌临床分离株的 DNA进行 PCR扩增 ,观察产物电泳带型的差异。结果 :在 3种引物的扩增产物中 ,均可见红色毛癣菌和须癣毛癣菌呈现出不同的 DNA指纹 ,其中 ,以引物 (GACA) 4扩增的条带差异最为清晰。结论 :红色毛癣菌和须癣毛癣菌可以用 PCR方法加以鉴别 ,以 (GACA ) 4作引物区分这两种菌较为合适。