红色荧光蛋白mCherry中插入外源短肽位点的研究

荧光蛋白及其突变体广泛应用于细胞生物学、分子生物学及医学等领域,而围绕荧光蛋白建立的各种新技术,如BiFC(双分子荧光互补技术)、FRET(荧光能量共振转移技术)、Optical highlighter(荧光笔探针)等,则极大地促进了多个生物相关学科的发展。采用转座子突变技术,在红色荧光蛋白mCherry中随机插入5个氨基酸残基。经流式细胞仪检测和分选,成功获得13个插入外源氨基酸短肽后,仍具有荧光活性的mCherry荧光蛋白突变体,为BiFC以及构建新型生物感受器提供了更多可插入外源DNA的合适位点。

利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代

转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良,其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节。本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库SGN-TEA搜索结果,克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因SlOLE1(Solyc06g034040)。利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因TagRFP的编码区序列插入到SlOLE1基因的终止密码子前,形成一个嵌合基因SlOLE1-TagRFP。将嵌合基因插入到pBI121双元载体,构建植物表达载体pSlOLE1-TagRFP,利用农杆菌介导法转化番茄品种‘Money Maker’,T_(0)代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光。PCR分子标记进一步验证发现,红色荧光种子萌发的幼苗均存在TagRFP序列,表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为100%。由此,本研究建立了一种利用SlOLE1-TagRFP嵌合基因,可以通过种子红色荧光可视化分析,简单快速、低成本地鉴定转基因番茄后代的方法。

不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和mCherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和mCherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。

越南伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记及功能稳定性

利用氨基纳米黏土介导的转化方法,应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中,采用细菌培养法、继代培养法和平板对峙培养法检测标记菌株的功能稳定性。通过氨基纳米黏土转化体系成功获得了荧光标记菌株B418-DsRed,与野生菌株B418相比,其生长曲线和形态学特征基本一致。继代培养10代后,标记菌株在共聚焦显微镜下呈现亮红色荧光,能够提取到外源质粒pGEX-4T-1-DsRed,并通过聚合酶链式反应扩增获得荧光基因序列DsRed,证明标记菌株具有较好的遗传稳定性。平板对峙培养试验显示,标记菌株B418-DsRed对尖孢镰孢菌和大丽轮枝菌抑制率分别为55.25%和67.55%,与野生菌株B418无显著性差异,表明外源质粒的导入未影响菌株的抑菌能力。以上结果表明通过氨基纳米黏土介导成功实现了伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记,构建的标记菌株B418-DsRed可用于该生防菌在植物根际的定殖及与病原菌的互作研究。

红色荧光蛋白mCherry在衣原体感染模型中的应用

目的建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法,并使用荧光菌株Cm-mCherry构建有效的衣原体感染模型。方法构建含有红色荧光蛋白mCherry的重组质粒pmCherry::CM,利用氯化钙法将pmCherry::CM转化至衣原体质粒缺失株CMUT中,经过筛选与纯化得到荧光菌株Cm-mCherry。Cm-mCherry感染HeLa229细胞后观察包涵体中红色荧光的发光情况,并与间接免疫荧光染色法比较,评估细胞感染模型构建是否成功;Cm-mCherry感染小鼠后,通过测定下生殖道载菌量、冷冻切片观察上生殖道衣原体红色荧光、分离生殖道评价输卵管积水发病情况,确定Cm-mCherry的感染力、侵袭力与致病性,评估动物感染模型构建是否成功。结果红色荧光蛋白mCherry在转化株Cm-mCherry中稳定表达,红色荧光蛋白标记法与间接免疫荧光染色法一致度高;Cm-mCherry小鼠感染模型中,感染率为100%(10/10),下生殖道载菌量可稳定保持高水平,在上生殖道冷冻切片中可观察到带有红色荧光的包涵体,输卵管积水发病程度与Cm野生株差异无统计学意义(P>0.05),证实Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性。结论成功建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法,转化后的荧光菌株Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性,可用于衣原体细胞、动物感染模型的构建,为研究衣原体感染机制提供良好的实验工具。

转红色荧光蛋白基因唐鱼的遗传分析和生物学研究

转红色荧光蛋白基因唐鱼(Tanichthys albonubes)测交获得实验鱼,以表达红色荧光蛋白为表型性状,采用点杂交和遗传学分析相结合的方法,研究外源基因的遗传传递规律,并对转基因唐鱼和非转基因唐鱼的生长和繁殖等方面进行了比较。结果显示:测交后代表型的分离规律基本符合经典的孟德尔单显性基因遗传模式,外源基因属于单位点整合,测交后代中没有发现沉默整合个体;实验鱼的生长和可量性状对比实验表明,转基因唐鱼和非转基因唐鱼在仔鱼期到性成熟之间,生长速度无显著差异,性成熟个体的外部形态除体色外也无差别,繁殖力方面基本无显著差异。本研究结果表明了培育转红色荧光蛋白基因唐鱼纯系的可行性;同时在生长、繁殖方面的研究结果为评价转基因唐鱼的生态安全奠定了基础。

红色荧光蛋白基因在转基因唐鱼中的表达

在成功构建斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子转红色荧光蛋白基因唐鱼Tanichthys albonubes可遗传品系的基础上,作者采用荧光显微镜观察和用RT-PCR技术对外源基因在唐鱼体内的表达情况进行检测。结果表明:红色荧光蛋白基因在F3代唐鱼体内的表达最早出现在受精后19 d,多数个体的表达集中在25~30日龄,最晚的表达个体出现在35日龄;红色荧光蛋白的表达主要分布于肌肉、心脏、肝脏、脾、鳃、鳔、肠和性腺,在肌肉、肝脏、鳃组织中的相对表达量较其它组织高,而在表皮和鳍条中没有检测到外源基因的表达。虽然红色荧光蛋白在转基因唐鱼后代出现表达迟缓、表达特异性改变的现象,但在外源基因后代中的遗传和表达在总体上还是稳定的,有望培育出转红色荧光蛋白基因唐鱼品系。

红色荧光蛋白的光谱多样性及体外分子进化

从珊瑚中来源的各种红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)经过一系列体外进化,其波谱范围覆盖了570～655nm,极大地丰富了细胞内或体内光学成像的荧光探针.简要阐述了来源于Discosoma sp.,Entacmaea quadricolor,Anemonia sulcata,Heteractis crispa,Actinia equina5种珊瑚的红色荧光蛋白的光学特征、结构、体外分子进化及其应用.

红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的表达和观察及其在本科实验教学中的应用

用PCR方法从质粒pDsRed2-1中扩增获得DsRed2,亚克隆到pMD19-T载体上,然后酶切将DsRed2分别插入到原核表达载体pET-Trx和pGEX-4T1上,转入E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.在LB平板培养基上或液体培养基中直接观察菌体颜色,最后用SDS-PAGE检测DsRed2蛋白的表达.结果显示构建的重组载体pET-Trx-DsRed2和pGEX-GST-DsRed2在E.coli中成功表达,且不形成多聚体.LB平板培养基上和IPTG诱导24h后的液体培养基中都能直接观察到红色荧光,说明DsRed2可以作为原核表达系统的报告基因.

基于mCherry荧光蛋白的植物基因过表达遗传转化系统的初步研究

过量表达是植物基因功能鉴定和农作物遗传改良的重要途径。为了提高转基因植株的研究效率,以m Cherry红色荧光蛋白为报告基因,构建了由玉米泛素启动子(P-Ubi)和豌豆T3A-poly A序列组成过量表达框的转基因载体。分别将4个水稻类受体激酶的编码序列插入表达框,通过农杆菌介导转化水稻品种泰粳394。转基因植株T1种子的m Cherry荧光检测结果表明,平均62.5%的T1株系呈3∶1分离。根据实时定量RT-PCR分析结果,过表达阳性植株的目的基因相对表达量显著高于阴性植株和未转化的泰粳394。运用该载体系统,能够进行转基因后代大规模筛选,获得目的基因过量表达的转基因株系,从而促进植物基因功能研究和转基因应用研究。

绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共转染骨髓间充质干细胞、乳鼠心肌细胞、Eahy926细胞表达特征的共聚焦分析

目的利用携带绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)报告基因的慢病毒载体共转染,观察2种报告基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)、乳鼠心肌细胞(Myo)和内皮细胞株(Eahy926)中的整合表达特征。方法应用人类1型免疫缺陷病毒改造而构建慢病毒载体,将GFP、RFP以同时或先后方式共转染hMSC、乳鼠Myo和Eahy926细胞,激光共聚焦显微镜观察2种报告基因在不同细胞中的共表达特点。结果 3种细胞均能被GFP、RFP共转染,其中hMSC和乳鼠Myo均有竞争加随机转染方式,Eahy926只有随机转染方式;3种细胞转染GFP、RFP的效率有所不同,共表达2种报告基因的细胞表现为以核为中心的表达区域重叠。结论 hMSC、乳鼠Myo和Eahy926细胞均可共转染2种报告基因,但整合方式有所不同,这将对利用多个报告基因同时示踪细胞多种生命特征提供有力帮助。

红色荧光蛋白与卵白蛋白表位融合蛋白的表达与纯化

目的构建红色荧光蛋白(dsRed)与卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)表位融合蛋白的高效表达质粒,并表达与纯化此红荧光蛋白标记的OVA模式抗原。方法合成的寡聚核甘酸变性退火成双链DNA接头,此接头含有OVA257-264表位的编码序列和一个AgeⅠ酶切位点,然后将其与dsRed蛋白编码序列克隆连接进pET16b,此表达质粒(pET-16bOR)转化大肠杆菌BL21,异丙基硫代半糖苷诱导表达后,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的表达,并进一步经Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化,SDS-PAGE和Westernblot分析纯化的融合蛋白。结果成功构建dsRed与OVA表位融合蛋白的高效表达质粒pET-16bOR,此融合蛋白能被488nm和568nm激发荧光,此蛋白被纯化并经SDS-PAGE和Westernblot分析证实。结论红荧光蛋白与OVA表位的融合蛋白具有荧光特性,并在大肠杆菌表达、纯化,可作为进一步分析抗原递呈的模式抗原。

红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立

背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。

红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定

以p ET-28a-RFP质粒为模板,PCR扩增红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因,并克隆到真核表达载体p TE11上,置于RP27启动子调控之下,成功构建表达载体p TE11-RFP。采用PEG介导转化法,将p TE11-RFP转入银耳芽孢中。提取转化子基因组DNA,RFP基因特异性引物扩增获得与目的基因大小一致的特异条带;日光下肉眼观察转化子略显红色,荧光显微镜观察有明显的红色荧光。以上结果证明RFP基因已成功转入银耳芽孢并进行表达,RP27启动子可以调控外源基因RFP在银耳芽孢中的正确表达,为进一步研究外源基因在银耳芽孢生物反应器中的高效表达奠定了一定的基础。

p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体。方法将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上,随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、PCR和测序证明正确无误,并在HeLa细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中,细胞核中也有一定的分布。结论成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。

MuSK-mCherry融合荧光蛋白的构建及对重症肌无力患者MuSK抗体的检测

目的:构建肌肉特异性激酶(MuSK)与红色荧光蛋白(mCherry)的重组融合蛋白(MuSK-mCherry),并作为抗原用于重症肌无力(MG)患者血清中的MuSK抗体(MuSKAb)的检测。方法:应用PCR技术,从含有mCherry基因的载体pRSET-B扩增mCherry基因,经T载体(pGEM-T Easy Vector)克隆至含有MuSK细胞外区第22-452位氨基酸肽段基因的载体pMT/BiP/V5-His(MuSK)上,构建MuSK-mCherry融合荧光蛋白基因。将重组载体转染果蝇S2细胞,表达产物以共聚焦显微镜检查。以MuSK-mCherry融合蛋白作为抗原,应用荧光免疫沉淀试验检测MG患者MuSKAb。结果:成功地构建了MuSKmCherry融合蛋白基因,并得到了表达。经对已知MuSKAb阳性的MG患者血清中的MuSKAb的检测证实,构建的MuSKmCherry融合蛋白在荧光免疫沉淀试验中可以检测到MuSKAb。结论:以MuSK细胞外肽段与mCherry构建的融合荧光蛋白作为抗原,可以用于MG患者血清中的MuSKAb的检测。

DsRED红色荧光蛋白植物表达载体的构建和表达

为获得红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)真核表达载体35S-pC1301-DsRED,利用PCR将瞬时表达载体PGDR上的全长DsRED扩增下来并用XbaⅠ和BamHⅠ酶切该片段,同时用相同的内切酶消化中间载体pBluescript SK(+),连接两片段并测序,将鉴定正确的DsRED用相同的内切酶切下并导入双元载体35S-pC1301,利用基因枪将正确质粒转染洋葱内表皮细胞瞬时表达DsRED。结果表明:35S-pC1301-DsRED真核表达载体已成功构建并在荧光共聚焦显微镜下呈现红光,即获得了可产生红色荧光的35S-pC1301-DsRED载体,为今后植物目的基因定位提供了阳性对照,同时中间载体pBluescript SK(+)-DsRED的构建为今后植物目的基因定位提供了实验工具。

利用红色荧光蛋白分析里氏木霉合成纤维素酶的机理

以红色荧光蛋白作为报告蛋白研究了里氏木霉的纤维素酶合成机理。构建了里氏木霉的表达盒,通过该表达盒使红色荧光蛋白的基因整合到里氏木霉的基因组DNA上,并受纤维二糖水解酶基因启动子的调控,得到重组菌株T.reeseiTR2。在不同的条件下培养T.reeseiTR2,红色荧光蛋白的表达情况可以反映在不同条件下里氏木霉合成纤维素酶的情况。在诱导的情况下,红色荧光蛋白随时间变化的情况与培养液中纤维素酶活性的变化相似,培养至36h后可以观察到荧光,并且不断增强,到菌丝自溶时荧光减弱。另一方面,诱导后里氏木霉菌丝的各个部位均可以观察到荧光,而且分布均匀,表明菌丝的各个部位在纤维素酶合成过程中所起的作用相同。在非诱导的情况下,培养时间较长时也可以观察到较弱的荧光,表明在此条件下里氏木霉仍可以合成少量的纤维素酶,这一结果为解释纤维素诱导里氏木霉合成纤维素酶的机理提供了另一个试验依据。

RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达

目的构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用。方法利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可调控载体pRS17-RUDsRed。在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达。结果PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性。没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达。结论成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的基因表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础。

鮰爱德华氏菌的红色荧光蛋白标记及其应用

为研究鮰爱德华氏菌与宿主的相互作用关系,本研究构建带有红色荧光蛋白基因的pMDmCherry表达载体,通过电击转化法将载体成功导入鮰爱德华氏菌zbl141菌株中,获得了红色荧光蛋白标记的鮰爱德华氏菌菌株。在倒置荧光显微镜下观察,重组鮰爱德华氏菌显示特异性红色荧光。稳定性检测结果表明,标记菌株传至28代,重组质粒稳定率仍为100%。用标记菌株感染斑马鱼仔鱼后,能在激光共聚焦显微镜下实时观察到细菌在鱼体内的分布情况;标记菌株体外感染小鼠巨噬细胞后,也能观察到病原菌与巨噬细胞的相互作用情况。说明标记菌株具有良好的特异性和可视性,为鮰爱德华氏菌对宿主的致病性研究提供了一种良好的生物材料。