红色诺卡菌固体培养基配方的优化

应用响应面优化设计法优化固体培养基配方,增大红色诺卡菌的固体培养细胞生物量。首先用Plackett-Burman法从现有培养基组分中找到影响红色诺卡菌细胞生物量的关键因素,再通过最陡爬坡法确定细胞生物量最大的配方,用作中心组合设计(Central Composite Design, CCD)实验的基础起始值,拟合数学模型方程,最后找到最优组分的组合。优化的配方转移至企业实施放大实验,对结果进行验证和比较。试验结果表明,培养基各组分中影响红色诺卡菌细胞生物量的关键因素为蛋白胨、NaCl、牛肉膏;最优固体培养基配方:蛋白胨42 g/L、牛肉膏8 g/L、NaCl 1.2 g/L、甘油10 mL/L、Na_(2)HPO_(4)·12H_(2)O 0.3 g/L、琼脂20 g/L。在细胞生物量方面最优固体培养基配方比原配方高104%。响应面优化设计可用于提高红色诺卡菌细胞生物量固体培养基的优化,也为红色诺卡菌培养条件、液体发酵的优化研究提供参考。

红色诺卡菌细胞壁骨架治疗恶性胸腔积液50例

目的 :探讨胸腔内注射红色诺卡菌细胞壁骨架 (NRWS)治疗恶性胸腔积液的疗效。方法 :恶性胸腔积液患者 50例 ,经胸腔闭式引流排净胸腔积液后 ,在胸腔内注射NRWS 60 0 μg ,1周 2次 ,共 2或 3次。 结果 :50例中完全缓解2 7例 ,部分缓解 18例 ,总有效率为 90 .0 %。结论

红色诺卡菌细胞壁骨架治疗恶性胸腹水29例分析

红色诺卡菌细胞壁骨架(胞必佳,N-CWS)为福建省微生物研究所研制由福建省天神微生物工程有限公司生产的新药.临床Ⅱ期研究表明,胞必佳注入胸腹腔,可使胸腹水减少或消失.按照卫生部规定,由中华医学会组织Ⅲ期临床试验(医学会药评字96第272号)进一步考察N-CWS的疗效、不良反应以期对其安全性和有效性作出确认性评价,我院于1997年6月～1998年12月对其进行了临床验证.现将结果报告如下.1 材料与方法1.1 药物来源 由福建省天神微生物工程有限公司生产的白色粉针剂,每瓶含量为200μg.1.2 病例选择(1)经病理组织学确诊的晚期恶性肿瘤患者(初治/复治不限),预计生存期≥3月,同意试用本品者.(2)年龄为18岁～70岁,性别不限.(3)具有可测量的胸、腹水或其它可靠的客观疗效评定指标.(4)距上次放、化疗结束后至少1个月以上.(5)心、肝、肾功能基本正常.(6)无严重药物过敏史.

红色诺卡菌细胞壁骨架多糖组分诱导免疫抗肿瘤作用

目的评价红色诺卡菌细胞壁骨架(Nocardia rubracell wall skeleton,Nr-CWS)多糖组分对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,对巨噬细胞、NK、LAK、CTL细胞增殖活化的诱导以及对HeLa细胞的杀伤作用,并阐述其诱导免疫发挥抗肿瘤作用的机制。方法 MTT法检测Nr-CWS多糖组分对HeLa细胞的抑制作用和促进NK、LAK、CTL细胞及对宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用;采用ELISA法分别测定经Nr-CWS多糖组分作用后NK、LAK、CTL细胞中IL-12、IFN-γ等相关炎症因子水平,Real-time PCR检测NK、LAK和CTL细胞NKG2D mRNA表达,Western blot检测NK、LAK和CTL细胞NKG2D蛋白表达和HeLa细胞NKG2D配体ULBP1、ULBP2和MICA的蛋白表达;评价Nr-CWS多糖组分诱导免疫和杀伤肿瘤细胞的作用。结果 Nr-CWS多糖提取物具有明显增强NK、LAK、CTL细胞增殖活化和杀伤宫颈癌HeLa细胞的作用,并呈剂量-时间依赖性,同时上调HeLa细胞NKG2D配体表达,使其敏感性增强。结论 Nr-CWS多糖提取物可通过诱导NK、LAK、CTL细胞增殖活化,增强其对宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用,同时使HeLa细胞对前者敏感性增强,从而发挥抗肿瘤作用。

红色诺卡菌细胞壁骨架胸腔注射治疗恶性胸腔积液

目的 :观察红色诺卡菌细胞壁骨架 (N CWS)胸腔内注射治疗恶性胸腔积液的临床疗效。方法 :60例恶性胸腔积液病人行胸腔闭式引流尽量放尽胸液后分成 2组 ,N CWS组 30例 ,男性 19例 ,女性 11例 ,年龄 62a±s 11a ,将N CWS每次 4 0 0～ 60 0 μg溶于氯化钠注射液 2 0mL ,注入胸腔内 ,qw ,连续 2次 ;薏苡仁组 30例 ,男性 17例 ,女性 13例 ,年龄 63a± 10a ,将薏苡仁注射液每次 10 0～ 2 0 0mL ,注入胸腔内 ,qw ,连续 2次 ,观察胸腔积液控制效果及其不良反应。结果 :N CWS组有效率为87% ,薏苡仁组为 57% ,2组差异有显著意义 (P <0 .0 5)。结论 :N CWS治疗恶性胸腔积液效果较薏苡仁注射液佳。

红色诺卡菌细胞壁骨架加顺铂胸腔内注射治疗恶性胸腔积液36例

目的:探讨国产红色诺卡菌细胞壁骨架(胞必佳)加顺铂对恶性肿瘤患者胸腔积液的疗效和安全性。方法:68例患者随机分为治疗组36例和对照组32例。治疗组于胸腔积液引流后用胞必佳600μg,顺铂40～60mg,地塞米松10mg,利多卡因10mL,生理氯化钠溶液40mL,胸膜腔内注射,每周1～2次,连续2～6次。对照组除不用胞必佳外外,其他治疗同治疗组。给药后每周查血、尿常规及肝肾、心功能,详细记录胸腔内给药前后的有关症状;给药后3d和2周、4周分别作B超检查。结果:治疗组有效率94.4%,对照组有效率46.9%,治疗组疗效明显优于对照组(P<0.01)。两组药物不良反应均表现为呕吐、胸痛、发热和白细胞减少等,对照组发生率较低,但与治疗组比较无显著差异。结论:胞必佳加顺铂胸腔内注射治疗恶性胸腔积液明显优于单用顺铂组,方法较为简便、安全,适用于临床推广。

红色诺卡菌细胞壁骨架中化学成分的鉴别与单糖含量测定

目的分析鉴别红色诺卡菌细胞壁骨架(Nr-CWS)中的化学成分,并对其中的单糖成分进行分析测定。方法首先,采用UHPLC-Q-TOF/MS方法对Nr-CWS提取物中的化学成分进行分离与分析,通过与Metlin数据库中代谢物成分信息比对,快速鉴别其中化学成分。然后,对Nr-CWS提取物中多糖水解后衍生化,采用UHPLC-MS/MS法对单糖衍生物进行定量分析,测定单糖的含量。结果共鉴别出Nr-CWS提取物中的64个化学成分,主要包括氨基酸、单糖、脂肪酸等成分。此外,建立了8种单糖柱前衍生化的UHPLC-MS/MS含量测定方法,含量测定结果表明,Nr-CWS中阿拉伯糖和半乳糖的含量最高,说明阿拉伯糖、半乳糖是组成Nr-CWS中多糖的主要组成成分。结论通过对Nr-CWS中的主要化学成分进行了分离与分析,对多糖水解后的单糖成分进行含量测定,为今后开展Nr-CWS活性成分的筛选及药理作用机制的研究奠定基础。

红色诺卡氏菌高产菌的ARTP诱变选育与发酵条件优化

以红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)FIM-PO8为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变,经筛选获得遗传较稳定的Nocardia rubra高产菌株FIM-PO8-16,并通过单因素实验和正交实验优化了菌株FIM-PO8-16的发酵工艺。确定最佳发酵培养基组分为:酵母粉2.5%、葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、糊精1.0%;最佳发酵条件为:种子液菌龄30 h、初始pH值7.2、接种量2.0%、装料量100 mL/500 mL、转速230 r·min^(-1)、发酵温度32℃。在此条件下,FIM-PO8-16菌体细胞浓度大幅提高,达到8.31%。

外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架治疗子宫颈锥切术后高危型HPV持续感染的临床疗效分析

目的:探讨外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架(Nr-CWS)治疗子宫颈锥切术后高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染的临床疗效。方法:选择2019年1月至2021年1月因HR-HPV感染引起子宫颈高级别上皮内病变(HSIL),于青岛大学附属青岛妇女儿童医院行子宫颈冷刀锥切术,术后6个月复查HR-HPV持续感染的69例患者为研究对象,并随机分为治疗组(Nr-CWS治疗1个疗程,36例)和对照组(仅观察,33例)。统计患者治疗有效率、阴道微生态变化及副反应发生的情况。结果:①69例患者中,治疗组治疗有效率(80.56%)明显高于对照组(39.39%),差异有统计学意义(P<0.05)。②治疗组乳杆菌患者的比率较对照组增加明显(77.78%vs.45.45%,P<0.05);治疗组pH值≥4.6、白细胞酯酶(LE)阳性患者的比率较对照组及治疗前均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。③治疗组36例患者中发热5例,下腹坠胀感5例,腹泻1例,皮疹1例。结论:Nr-CWS治疗子宫颈锥切术后持续HR-HPV感染疗效较好,阴道微生态环境指标(乳杆菌、LE、pH值≥4.6)改善明显,且无严重副反应发生,但仍需从卫生经济学角度出发,根据患者情况综合考虑。

外涂红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对人乳头瘤病毒感染并宫颈上皮瘤变患者宫颈环形电切术后人乳头瘤病毒转阴和阴道微生态的影响

目的探讨外涂红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(Nr-CWS)对人乳头瘤病毒(HPV)感染并宫颈上皮瘤变(CIN)患者宫颈环形电切术(LEEP)术后HPV转阴率和阴道微生态的影响。方法采用随机数字表法将2019年1月至2022年1月于邯郸市妇幼保健院妇科就诊的95例HPV感染并CIN患者分为观察组(n=48)和对照组(n=47),所有患者均行LEEP治疗,对照组术后予常规治疗,观察组在此基础上予Nr-CWS治疗,连续治疗3个月。比较两组HPV转阴率、阴道微生态情况,检测外周血T细胞亚群及宫颈局部干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-2及IL-10水平。结果治疗2个月、3个月后,观察组HPV转阴率明显高于对照组(54.17%vs.30.42%、72.92%vs.51.06%,P<0.05)。治疗后,观察组阴道微生态异常率显著低于对照组(29.17%vs.59.57%,P<0.05)。治疗后,两组外周血CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)及阴道灌洗液IFN-γ、IL-2较治疗前升高,而阴道灌洗液IL-10降低,且观察组上述指标优于对照组(P<0.05)。结论外涂Nr-CWS可提高HPV感染并CIN患者LEEP术后HPV转阴率,纠正阴道微生态,其机制可能与提高外周血T淋巴细胞和宫颈局部免疫因子有关。

红色诺卡菌细胞壁骨架对人中性粒细胞生物学功能的调节作用

目的探讨红色诺卡菌细胞壁骨架(Nr-CWS)对人中性粒细胞生物学功能的调节作用及其机制。方法采用实验研究方法。2022年5―10月招募于苏州市体检中心体检的成年健康志愿者15名(男7名、女8名,年龄24~45岁),采集外周静脉血,采用免疫磁珠分选法提取中性粒细胞。将细胞分为不进行任何处理的正常对照组、仅用终质量浓度为60 ng/mL Nr-CWS处理的单纯Nr-CWS组、仅用终质量浓度1μg/mL内毒素/脂多糖(LPS)刺激的单纯LPS组、用同前LPS刺激后再用Nr-CWS处理的LPS+Nr-CWS组。培养1 h,采用改良后的琼脂糖趋化模型检测中性粒细胞的趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数、最大趋化速度、趋化功能评分;采用流式细胞术检测发生吞噬的细胞占比与荧光强度,活性氧水平,颗粒蛋白CD35、CD66b、CD63的蛋白表达水平,以及细胞培养上清液中炎症因子白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素浓度。以上实验各组样本数均为15。对数据行析因设计方差分析与独立样本t检验。结果培养1 h,正常对照组、单纯Nr-CWS组、单纯LPS组、LPS+Nr-CWS组细胞趋化功能评分分别为15.0、(14.5±0.5)、(1.5±0.5)、(12.0±1.5)分;与正常对照组比较,单纯LPS组与LPS+Nr-CWS组细胞趋化距离、趋化细胞百分比、趋化指数、最大趋化速度与趋化功能评分均显著降低(t值分别为18.36、18.88、54.28、18.36、46.77,10.58、14.74、6.84、10.58、4.24,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞上述5项趋化功能指标均显著升高(t值分别为11.47、14.65、11.62、11.47、13.75,P<0.05)。培养1 h,与正常对照组比较,单纯Nr-CWS组发生吞噬的细胞占比与荧光强度均显著升高(t值分别为6.86、6.73,P<0.05),单纯LPS组(t值分别为7.35、22.72,P<0.05)与LPS+Nr-CWS组(t值分别为21.37、13.10,P<0.05)发生吞噬的细胞占比与荧光强度均明显降低。培养1 h,与正常对照组比较,单纯LPS组细胞活性氧水平显著升高(t=6.64,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞活性氧水平明显降低(t=5.46,P<0.05)。培养1 h,与正常对照组比较,单纯LPS组与LPS+Nr-CWS组细胞CD35、CD66b、CD63蛋白表达均显著升高(t值分别为16.75、17.45、10.82,5.70、19.35、15.37,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞CD35、CD66b、CD63蛋白表达均明显下降(t值分别为4.92、5.72、3.18,P<0.05)。培养1 h,与正常对照组比较,单纯LPS组细胞培养上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、γ干扰素浓度均显著升高(t值分别为22.10、9.50、7.21、10.22、24.88、8.43、47.48,P<0.05),LPS+Nr-CWS组细胞培养上清液中IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、γ干扰素浓度均显著上升(t值分别为4.68、5.12、8.02、5.58、7.13,P<0.05);与单纯LPS组比较,LPS+Nr-CWS组细胞培养上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、γ干扰素浓度均显著降低(t值分别为5.39、2.83、5.79、2.90、5.87、4.88、39.64,P<0.05)。结论Nr-CWS能够提高正常状态下人中性粒细胞的吞噬能力,改善感染状态下人中性粒细胞的趋化功能及活性氧、脱颗粒蛋白、炎症因子水平,在先天免疫层面通过调控人中性粒细胞生物学行为,提高抗感染能力。

红色诺卡氏菌细胞壁骨架乳液的制备及其安全性研究

以红色诺卡氏菌细胞壁骨架原液以及多种植物提取物为原料制备了一种乳液,并对乳液微生物指标、重金属含量及稳定性以及对KM小鼠破损皮肤修复效果的安全性研究进行评价。结果表明,制备的乳液菌落总数、霉菌和酵母菌数均小于10 CFU/g,耐热大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均未检出;铅、汞、砷、镉重金属含量均未超标;离心试验未发现分层,在耐热、耐寒试验条件下,乳液颜色未发生改变,稳定性良好。小鼠动物实验结果表明,小鼠皮肤破损处涂抹乳液14天愈合率达到了95.80%,比对照组和空白组均提前7 d左右达到90%以上愈合率,无红肿及渗出。表明开发的乳液具有良好的配伍性,性质稳定,无刺激性、过敏性及毒性,可以安全可靠地应用于各行业。

红色诺卡菌细胞壁骨架术中冲洗创面影响乳腺癌术后引流量的前瞻性研究

目的 探讨红色诺卡菌细胞壁骨架(N-CWS)术中冲洗创面用于减少乳腺癌乳房全切除术后引流量和降低皮下积液发生率的有效性和安全性。方法 连续纳入2020年1~6月间在河北医科大学第四医院行乳房单纯切除术或改良根治术的女性乳腺癌病人145例,采用有放回的双色球抽签法随机选择40例分至试验组,在术中应用N-CWS 800μg+生理盐水50 mL进行切除术后的创口冲洗;其余105例分至对照组,仅用等量生理盐水冲洗创面。记录并比较两组病人术后0~24 h和>24~48 h的引流量、引流管置留天数、术后住院天数、手术相关并发症(切口感染、皮下积液和皮瓣坏死)发生率及其差异。结果 试验组病人的术后>24~48 h引流量、引流管置留时间和术后住院时间均显著少于对照组(P<0.05),术后0~24 h引流量差异无统计学意义(Z=-1.190,P=0.234)。试验组术后出现发热24例(60.0%),其比例大于对照组27例(25.7%,P<0.001),但两组病人中发热病例的发热时间差异无统计学意义(Z=-0.568,P=0.570)。对照组出现腋窝皮下积液1例(1.0%),两组均未见切口感染和皮瓣坏死。结论 乳腺癌乳房全切除术中应用N-CWS冲洗创面可显著减少术后引流量、引流管置留时间和住院时间,有效预防术后皮下积液,安全可行。

红色诺卡菌细胞壁骨架胶囊的制备及其生物学活性

目的制备红色诺卡菌细胞壁骨架(N-CWS)胶囊,并检测其生物学活性。方法采用超声波法和冷冻干燥法制备N-CWS胶囊,并通过影响因素试验、加速试验及长期试验考察其稳定性,通过小鼠抑瘤试验检测其生物学活性。结果所制备的N-CWS胶囊各项质量指标均符合相关要求,稳定性良好;口服给药对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用。结论本实验制备的N-CWS胶囊质量稳定,抗肿瘤活性强,适于工业化生产。

红色诺卡氏菌细胞壁骨架的理化性质、化学成分及含量测定的研究

对红色诺卡氏菌细胞壁骨架 (N CWS)的理化性质、化学成分进行研究 ,并建立其含量测定的方法。采用化学鉴别、光谱分析及比色法。结果表明由红色诺卡氏菌P0 8菌株制备的N CWS为白色粉末 ,性质稳定 ,不溶于水、甲醇等有机溶媒。含有类脂化合物 (1 7 1 % )、多糖 (阿拉伯半乳聚糖 46 3 % )、粘肽 (主要为丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、葡萄糖胺、胞壁酸 ) ;通过比色法测定N CWS中的阿拉伯糖并推算N CWS的含量 ,其重现性较好 ,小鼠抑瘤活性实验表明N CWS的含量与活性呈平衡关系。本文建立的测定方法可行。

红色诺卡氏菌对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

目的:观察红色诺卡氏菌(N·R)及其提取物—细胞壁骨架(N-CWS)对小鼠巨噬细胞(Macrophage,M)吞噬功能的影响。方法:取BALB/C小鼠30只随机分成3组,分别为生理盐水对照组、实验A组(N-CWS450mg/kg·d-1)及实验B组(N·R5400mg/kg·d-1),连续灌胃给药20d后,检测小鼠腹腔M的吞噬百分率及吞噬指数。结果:实验A、B组与对照组的吞噬百分率和吞噬指数相比差异有统计学意义(P<0·05,P<0·01);A、B组间的吞噬百分率及吞噬指数差别均无统计学意义(P>0·05)。结论:N-CWS/N·R灌胃给药对小鼠的M吞噬功能均有促进作用。

红色诺卡氏菌对S180的抑瘤效应研究

本文研究红色诺卡氏菌菌体对小鼠S180A的抑瘤活性。皮下注射给药，剂量分别为0．2、2、4、8、16mg／只，进行抑瘤试验。结果表明红色诺卡氏菌菌体具有明显的抑瘤活性，其抑瘤适宜量为8mg／只，抑癌率达90％以上。

红色诺卡氏菌细胞壁骨架治疗宫颈HPV亚临床感染的疗效评价

目的:评价宫颈局部外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(Nocardia rubra Cell Wall Skeleton,Nr-CWS)治疗宫颈人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)亚临床感染的疗效。方法:采用双盲随机对照试验设计,将宫颈HPV亚临床感染患者随机分入:实验组36例,安慰剂组12例,分别使用Nr-CWS和赋形剂。在治疗前、治疗后4个月及8个月,对患者进行宫颈HPV检测,细胞学检查和阴道镜评估,分析Nr-CWS对宫颈HPV亚临床感染的治疗效果。结果:4个月:治疗组有效率48.57%,对照组有效率25%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。8个月:治疗组有效率为65.71%,对照组有效率41.67%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Nr-CWS对宫颈HPV亚临床感染有一定的清除作用。

红色诺卡氏菌Nr-8206株培养形态与其有效物质及杂质关系分析

筛选红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)Nr-8206株适宜投产的最佳培养形态。将红色诺卡氏菌Nr-8206株复壮,通过涂布、形态学考察筛选典型菌落形态。通过发酵技术获得各种菌落形态菌株的生物量,进一步通过细胞破碎、化学提纯等方法获得细胞壁多糖产物,紫外可见光分光光度法进行有效物质含量测定及杂质的检测。结果表明,红色诺卡氏菌Nr-8206株的最佳菌落形态为菌落直径1.68 mm、橘色、有突起、有褶皱、菌落边缘丝状,编号RY2。进行菌株RY2发酵,其菌体量最多,经破碎、提纯后,其有效物质糖含量及胞壁酸含量均高于其他形态的菌落,并高于出发菌株Nr-8206,且其杂质蛋白质残余量更低,杂质更容易去除。该研究可供生产企业以该菌株作为工作菌株时提供形态选择参考。

鰤鱼诺卡氏菌与绛红色诺卡氏菌的融合菌研究

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)为鱼类诺卡氏菌病的主要病原,绛红色诺卡氏菌(N.purpurea)是分离自土壤中一种无毒诺卡氏菌。以鰤鱼诺卡氏菌和绛红色诺卡氏菌为亲本进行原生质体融合,获取融合菌。经生长特征观察、革兰染色、16SrRNA测序分析,对融合菌进行初步鉴定,并通过斑马鱼模型评估融合菌毒力检测和免疫保护效果。结果表明,融合菌的菌落形态与亲本菌株不同,为诺卡氏菌属革兰阳性菌,融合菌的毒力较鰤鱼诺卡氏菌野生株降低70%,免疫保护率约为50%。