真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响

在南方红豆杉细胞悬浮培养过程中 ,研究了在指数生长期的末期加入真菌诱导子 (尖孢镰刀菌的胞壁组分粗提物 )对细胞态势及紫杉醇合成的影响。结果表明 ,真菌诱导子能在短期内激发细胞的防御性应答反应而产生氧迸发 ,细胞的氧化还原态势发生了明显的变化 ,培养基发生碱化现象 ,表征酶含量的蛋白质含量明显提高 ,SOD、POD、CAT的活力出现波动性变化 ,并具有一定的时序性。同时 ,南方红豆杉悬浮培养体系中产次生代谢途径中重要的酶PAL的活力得到提高 ,紫杉醇的合成被加强 ,产量得到了显著提高 ,达到了对照组的 5倍左右。

培养基和培养条件与红豆杉细胞培养中褐化的关系

就近几年来通过培养基和培养条件的选择来控制和防止红豆杉细胞培养中的褐化问题作了介绍。

东北红豆杉细胞两液相培养生产紫杉醇的研究

反应-分离耦合技术是红豆杉细胞培养生产紫杉醇的关键技术。作者采用两液相培养技术，深入研究有机溶剂的种类、浓度、加入时间和相毒性对红豆杉细胞悬浮培养细胞生长和产生的影响。结果表明油酸和邻苯二甲酸二丁酯适合作此体系两液相培养的有机溶剂，合适的浓度为8％，加入时间为第7日～10日，与对照组相比，两液相培养的紫杉醇产量提高4倍。

寡聚糖诱导悬浮培养红豆杉细胞生理态势的改变

运用顺磁共振、电镜、能谱等手段研究了寡聚糖对红豆杉细胞氧化还原生理态势的影响 .结果表明 ,诱导前红豆杉细胞处于相对稳定的生长态势 ,细胞完整 ,细胞器发达 ;氧化还原电势较低 ,活性氧相关酶系统相对稳定 ,细胞初生代谢旺盛 ,紫杉醇合成速率很低 .诱导后红豆杉细胞向产物合成态势转移 ,SOD酶活性迅速提高 ,CAT和POD酶活被强烈抑制 ;细胞出现活性氧迸发 ,4h达最大值 ;细胞的氧化还原电势增高 ,细胞膜上离子通道被激活 ,H+ 和Ca2 + 内流 ,Cl-外流 ;液胞内出现大量含Ca2 + 离子的高电子致密区并呈规律性变化 ,培养环境碱化 ;细胞生长被抑制 ,紫杉醇合成速率升高 ,其产量提高了 5 5倍 ,达 76 1mg·L-1.

稀土元素铈对红豆杉细胞膜透性的影响

用EvansBlue染色、细胞培养液电导率测定、MDA含量检测、电镜技术研究Ce4+对悬浮培养的东北红豆杉细胞膜的影响。结果表明:1mmol/LCe4+诱导后第5天,EvansBlue染色结果、细胞培养液的电导率、MDA含量显著地增加,细胞膜透性明显增大,细胞膜的完整性也受到一定程度的破坏,透射电镜观察细胞超微结构发生变化,说明1mmol/LCe4+能导致悬浮培养的红豆杉细胞膜的损伤。

改良异硫氰酸胍一步法提取红豆杉细胞RNA

将Chomczynski建立的RNA一步分离法加以适当改进 ,用以提取红豆杉细胞株E2、TC、H2 1的总RNA ,所获RNA样品的A2 60 /A2 80 比值分别是 :1.82± 0 .0 3、1.85± 0 .0 4、1.74± 0 .0 3;A2 60 /A2 3 0 比值分别为 :2 .0 2± 0 .0 3、2 .15± 0 .0 3、2 .0 3± 0 .0 5 ;得率分别为 :5 1.36± 0 .0 5 μg/g、5 2 .4 0± 0 .0 4 μg/g、5 1.0 8± 0 .0 6 μg/g新鲜细胞。变性琼指糖凝胶电泳图谱显示每一样品均具有完好的 2 8S和

担子菌及其木质纤维素降解液在红豆杉细胞培养中的作用

研究了担子菌及其木质纤维素降解液在红豆杉细胞培养中的作用 ,结果表明 ,担子菌Bds及其木质纤维素降解液制备的诱导子对紫杉醇生物合成具有明显的促进作用 ,且以木质纤维素发酵至第 7天的降解液对紫杉醇生物合成的诱导作用最明显。因此 ,可以用担子菌Bds发酵木质纤维素所得的降解液制备紫杉醇生物合成的诱导子。

茉莉酸甲酯与真菌诱导物、水杨酸组合对红豆杉细胞中紫杉醇含量的影响

比较了茉莉酸甲酯与真菌诱导物、水杨酸组合对红豆杉细胞几个抗病相关指标（ＰＯＤ、ＣＡＴ活力、Ｈ２Ｏ２含量）及紫杉醇含量的影响，３种信号分子的组合对ＰＯＤ、ＣＡＴ、Ｈ２Ｏ２及紫杉醇含量的影响是不一致的，ＭＪ单独添加，ＭＪ与ＳＡ联合作用以及ＭＪ与Ｆ５联合作用都可使 ＰＯＤ活力增加，且１２ｈ后Ｈ２Ｏ２含量均升高，约在 ４８ｈ达到高峰，为对照的２倍左右，但 ７２ｈ后，ＭＪ单独添加和ＭＪ与ＳＡ联合作用组中Ｈ２Ｏ２含量变化不大，Ｆ５与ＭＪ联合作用则使Ｈ２Ｏ２含量持续比对照高。ＭＪ单独添加使ＣＡＴ酶活在１４４ｈ后才较对照低，Ｆ５、ＳＡ的加入都可使ＣＡＴ酶活下降，ＳＡ的作用更显著。说明三者的诱导途径并不完全一样，以 ＳＡ和 ＭＪ联合添加对紫杉醇合成的促进作用最大，含量达到细胞干重的 ０．０４％。

水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析

东北红豆杉悬浮培养体系中加入适量浓度的水杨酸 ,染色结果表明 ,水杨酸可以增加细胞膜通透性 ,并可诱导部分细胞发生核凝集或核碎裂。提取细胞染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳 ,发现染色体DNA发生了部分降解。应用蛋白质双向凝胶电泳技术 ,研究了水杨酸处理后东北红豆杉细胞发生应激反应过程中蛋白质的表达情况 ,分析了处理细胞与正常细胞的蛋白质组差异 ,发现在水杨酸处理 4 8h后的样品中有 7个蛋白质差异点 ,而且有6个蛋白点仅在对照中检测到。结果表明 ,外加水杨酸改变了东北红豆杉细胞的基因表达 ,抑制部分蛋白合成的同时也合成了部分新蛋白质 ,这些蛋白可能与水杨酸的作用有关。

红豆杉细胞同步化的研究

研究用低温处理使悬浮培养红豆杉细胞同步化。结果 ,细胞在 4℃处理 2 4h ,恢复培养 2 4h ,其分裂指数可达 10 2 6%。

东北红豆杉细胞两液相培养中紫杉醇释放行为研究

在东北红豆杉细胞悬浮培养中 ,分别研究了稀土化合物 (硫酸铈铵 )、有机溶剂 (油酸和邻苯二甲酸二丁脂 )和稀土化合物与有机溶剂的协同作用对紫杉醇释放的影响。在此基础上深入研究了在东北红豆杉细胞两液相培养中 ,紫杉醇释放率随不同的有机溶剂 (烷烃、有机酸、醇和脂 )、有机溶剂的体积分数、有机溶剂的加入时间和有机溶剂相毒性的变化规律。结果表明分别加入稀土化合物和有机溶剂都明显促进紫杉醇的释放 ,特别是有机溶剂更显著促进紫杉醇的释放。但在东北红豆杉细胞两液相培养中 ,稀土化合物加入不能进一步促进紫杉醇的释放。因此两液相培养中有机溶剂本身就是很好的产物释放剂。紫杉醇的释放率由对照组的 40 %提高到 75 %以上。

不同溶剂浸取红豆杉细胞中的紫杉醇的研究

用 7种单一溶剂浸取红豆杉细胞中的紫杉醇 ,研究表明 ,甲醇有最好的浸取效果 ,紫杉醇含量占细胞干重的 0 .0 331 5% ,在 2 3种混合溶剂中 ,CH3COOC2 H5/C2 H5OH ,CH3COCH3/CH3OH ,CH3COCH3/C2 H5OH ,CH3OH/CHCl3 浸取效果最好 ,其紫杉醇含量占细胞干重分别为 0 .0 51 66% ,0 .0 4 92 3 % ,0 .0 4 2 76% ,0 .0 3981 % .

稀土对红豆杉细胞内游离钙含量的影响

采用Fura2AM双波长荧光分光光度计测定了稀土不同作用时间和不同剂量,以及红豆杉细胞不同生长时期和在钙通道阻断剂存在的情况下,红豆杉细胞内游离钙离子浓度的变化.实验结果表明,稀土对红豆杉细胞内钙离子浓度的影响随作用时间和剂量的不同而改变,细胞不同的生长时期对稀土的敏感程度不同,此外发现稀土引起细胞内钙离子浓度的振荡是由于胞内钙库释放和胞外钙内流所致.

红豆杉细胞两液相体系中紫杉醇的分离研究

基于紫杉醇的光敏性和热敏性特点 ,且以三元萃取方法从两液相培养红豆杉细胞的有机溶剂中提取紫杉醇又不理想的情况下 ,本文提出了有机溶剂 -紫杉醇 -水-甲醇的多元萃取方法 ,并分别测定出甲醇在甲醇 -水 -油酸和甲醇 -水 -混合有机溶剂 (油酸和邻苯二甲酸二丁酯 )休系分配系数变化趋势图 ;分别测定出紫杉醇在甲醇 -水 -油酸和甲醇 -水 -混合有机溶剂体系分配系数变化趋势图。

茉莉酸甲酯诱导下红豆杉细胞产生紫杉烷类物质群代谢轮廓分析

红豆杉细胞培养物经甲醇提取和固相萃取粗分离,进行反相高效液相色谱分析,获得了约含13个与紫杉醇极性相关的化合物色谱图,通过质谱联用和对照品参照,归属了这些化合物组成。进一步利用茉莉酸甲酯(MJ)诱导细胞,比较这些组分在诱导前后的相对色谱峰面积变化,结果表明,所有紫杉烷组分的浓度在诱导后都提高,其中以taxchinin M及其结构类似物提高最显著,紫杉醇,B-Ⅲ和B-Ⅵ等比C14位取代的taxuyunnanine C及其衍生物的浓度增加幅度要大,提示MJ对紫杉醇合成中非有效乙酰化旁路代谢有促进作用,而对C14位取代物生成的旁路促进作用不明显。本文为紫杉醇的生物合成研究提供了新的思路和方法。

红豆杉细胞提取物抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的实验研究

目的 研究红豆杉细胞提取物对肝癌细胞 SMMC- 772 1的生长抑制作用及其机制。方法 运用台盼蓝拒染法测定肿瘤细胞生长曲线 ,流式细胞仪和 Giem sa染色分析肿瘤细胞周期和细胞凋亡。结果 红豆杉细胞二氯甲烷提取物对肝癌细胞 SMMC- 772 1的生长有明显的抑制作用 ,流式细胞仪分析发现 G2 / M期肿瘤细胞数量增多 ,经 Giem sa染色发现肿瘤细胞有凋亡发生。结论 红豆杉细胞提取物可以通过诱导细胞发生凋亡而抑制肝癌细胞SMMC- 772

茉莉酸甲酯对中国红豆杉细胞基因表达的mRNA差异显示研究

茉莉酸甲酯是一种环戊烷衍生物型植物激素,在植物次生代谢物质生物合成中起着重要作用。我们以中国红豆杉悬浮培养细胞为材料,设两组平行实验,一组为阴性对照组,一组以茉莉酸甲酯进行诱导,所得细胞利用mRNA差异显示技术进行分析,研究了茉莉酸甲酯对红豆杉细胞mRNA表达的差异,最终共获得34个差异表达片段。经二次扩增和单引物阴性对照实验及序列测定,共获得9个阳性差异表达片段。与GenBank数据库比对,结果表明其中2个片段与已知基因有较高的同源性,与欧洲赤松(Pinussylvestris)cDNA克隆的同源性为88%,与南方红豆杉(Taxusmairei)18SrRNA基因的同源性为93%,其余7个差异表达片段与GenBank中所有基因的同源性都非常低,可能代表了红豆杉细胞中的受茉莉酸甲酯诱导的未知基因序列。

红豆杉细胞抗病反应的诱导及其与紫杉醇合成的关系

采用从红豆杉植株不同部位 (叶、内皮、根等 )分离筛选获得的各种真菌制备的激发子 ,对 6种不同红豆杉细胞株进行诱导作用研究 .结果表明 ,不同细胞对不同真菌制备的激发子的抗病反应有显著的区别 ,并建立 3种植物 -真菌互作模式 :极不相容 (细胞抗性强 ,受损小 ) ,不相容 (抗性强 ,受损也较严重 ) ,相容 (细胞抗性小 ,受损严重 ) .结果还表明 ,极不相容和不相容互作模式中细胞中的紫杉醇产量显著高于CK ,而相容互作模式的细胞不含有紫杉醇 .同一真菌由不同的方法制备成的不同分子量大小或不同成分的激发子 ,对细胞的抗病反应与紫杉醇合成的影响不同 .这些结果为诱导作用机理及调控红豆杉细胞合成紫杉醇的研究具有指导意义 .图 6参

果糖补料与真菌诱导对红豆杉细胞悬浮培养体系的协同效应

研究了果糖补料和真菌诱导对南方红豆杉细胞悬浮培养体系中细胞生长状态和紫杉烷合成的协同作用。结果表明果糖补料和真菌诱导子的协同作用引起细胞的生理状态发生改变 ,培养基碱化 ,细胞的生物量有一定程度的降低 ,而表征酶含量的蛋白质含量有明显的提高 ,酚类物质大量积累 ,目的产物紫杉醇 (Taxol)被大量合成 ,其产量在摇瓶和反应器体系中最高分别达到 81.0mg/L和 71.7mg/L。

红豆杉细胞与赤霉菌交互诱导对红豆杉细胞紫杉醇含量的影响

在赤霉菌培养过程中加入红豆杉细胞诱导物，再用此赤霉菌诱导悬浮培养的红豆杉细胞。与未受植物来源物质作用的单向诱导相比，该交互诱导使红豆杉细胞的紫杉醇含量提高5倍，交互诱导的效果受诱导物的各类的影响，其中，诱导物是红豆杉细胞壁和赤霉菌细胞壁时，交互诱导效果最好。