红曲菌与酿酒酵母组合发酵对米酒挥发性风味组分生成的影响

红曲酒是以糯米为原料,以红曲作为发酵剂酿造而成的。其中红曲菌和酿酒酵母是酿造体系中的核心微生物。本文以糯米为发酵基质,选用紫色红曲菌、红色红曲菌和高粱红曲菌分别与酿酒酵母菌进行组合发酵,研究不同组合和发酵模式(同步发酵和顺序发酵)对挥发性组分生成的影响。基于顶空固相微萃取-气质联用法,从发酵的米酒中共鉴定出89种挥发性风味化合物。热图分析发现:红曲菌与酿酒酵母组合发酵明显比红曲菌纯菌发酵产生更多的挥发性物质,顺序发酵明显比同步发酵产生更多的挥发性风味物质,尤其是紫色红曲菌、红色红曲菌与酿酒酵母组合的顺序发酵。对不同红曲菌与酿酒酵母组合发酵的挥发性风味组分进行主成分分析,紫色红曲菌和红色红曲菌与酿酒酵母在顺序发酵模式下会产生更多的挥发性风味组分且其风味组成较为接近。挥发性风味组分含量差异分析表明,异丁醇、1-庚醇、(3Z)-3-壬烯-1-醇、2-十四醇、(Z)-5-辛烯-1-醇、癸醛、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、1,2-二甲氧基-4-乙烯基苯等是红曲菌与酿酒酵母组合发酵产物中的特征挥发性风味物质。本研究结果可为红曲酒工业化生产中风味品质的提升与质量控制提供一定的参考数据。

光调控红色红曲菌M7及MrVeA基因相关突变株的功能分析

为了探讨光调控对红色红曲菌(Monascus ruber)M7、MrVeA基因相关突变株ΔMrVeA、OEMrVeA功能的影响,采用MrVeA基因敲除、过表达技术分别构建基因缺失菌株(ΔMrVeA)和过表达菌株(OEMrVeA)。以避光(黑暗)为对照,分析红光和白光对红色红曲菌M7、MrVeA基因突变株ΔMrVeA、OEMrVeA生长发育、红曲色素(Mps)和桔霉素(CIT)产生的影响。结果表明,黑暗条件下,突变株OEMrVeA闭囊壳和分生孢子的产量增加,菌丝发育、菌落颜色、生物量及色素含量与红色红曲菌(M.ruber)M7相比均无显著性差异,但产桔霉素能力比菌株M7降低7.03%,说明MrVeA基因的过表达会促进菌株M7的有性/无性繁殖,抑制桔霉素的生成。红光有利于突变株OEMrVeA的生长发育、有性/无性繁殖、红曲色素的生成,不利于突变株OEMrVeA生成桔霉素;白光不利于突变株OEMrVeA的生长发育、有性/无性繁殖、红曲色素的生成。研究结果可为低产甚至不产桔霉素的红曲菌工业化应用提供参考。

橙色红曲菌中Rab1与CtnE蛋白的亚细胞定位

红曲菌(Monascus)是我国传统的发酵菌株,在发酵过程中会产生一种具有肾毒性的真菌毒素——桔霉素(Citrinin,CIT)。桔霉素的存在极大地限制了红曲制品的应用与发展。明确红曲菌合成CIT的机制,对于开发抑制CIT合成的方法具有十分重要的意义。小G蛋白Rab1可以介导调控丝状真菌中蛋白的转运,ctnE基因编码红曲菌AS3.4384中CIT合成基因簇中的脱氢酶。然而,目前尚不清楚Rab1蛋白是否参与了CtnE蛋白的转运。通过农杆菌介导转化的方法构建了AS3.4384::Rab1-GFP(绿色荧光蛋白,Green Fluorescent Protein)和AS3.4384::Rab1-GFP::ctnE-mCherry(红色荧光蛋白,monomeric cherry red fluorescent protein)两种红曲菌株,并通过荧光共定位确定了Rab1蛋白和CtnE蛋白在菌体中的分布情况。结果表明,CtnE-mCherry蛋白大多聚集于红曲菌丝体的顶端以及分生孢子中,并在菌丝体内呈均匀弥散状分布。Rab1蛋白和CtnE蛋白在红曲菌体内的分布位点基本一致,表明CIT的合成与囊泡转运密切相关。通过Rab1蛋白与CtnE蛋白的荧光共定位情况进一步解析了CIT合成位点。

大豆分离蛋白对红曲菌产莫纳可林K和红曲色素的影响

为探究大豆分离蛋白(soybean protein isolate,SPI)对3株丛毛红曲菌(Monascus pilosus)和1株红色红曲菌(Monascus ruber)产莫纳可林K(monacolin K,MK)和红曲色素(Monascus pigments,MPs)的影响,采用紫外分光光度法和HPLC法分析红曲菌固态及液态发酵产物中MK和MPs的产量及其同系物。结果表明:在固态发酵条件下,添加1%SPI可促使M.ruber MJ-1红色MPs产量增加4.59倍(P<0.05);可显著抑制M.pilosus MS-1、M.pilosus YDJ-1产MPs,并促使3株丛毛红曲菌产MK(P<0.05)。在PDB培养基中,添加1%SPI可促使M.ruber MJ-1和M.pilosus YDJ-1产红、橙、黄3种MPs,促使M.pilosus YDJ-2产MK的量增加0.88倍(P<0.05)。在合成培养基中,添加1%SPI可促使M.ruber MJ-1和M.pilosus YDJ-1产3种MPs,可显著抑制M.pilosus MS-1产MPs(P<0.05);促使M.pilosus MS-1和M.pilosus YDJ-1产MK的量分别增加0.95和1.15倍(P<0.05)。上述研究结果可为利用大豆分离蛋白调控不同种属红曲菌选择性产MPs或MK提供参考。

高产色素和洛伐他汀红曲菌株的筛选、鉴定及发酵条件研究

红曲色素(Monascus pigments,MPs)和洛伐他汀(Lovastatin)是两种具有极高营养、保健和药用价值的红曲菌代谢产物,寻找挖掘高产MPs和洛伐他汀的红曲菌,具有重要实践意义。从土样中分离得到红曲菌A1和A2,在对其进行分类鉴定的基础上,采用分光光度法对MPs的色价和洛伐他汀含量进行测定,并通过单因素和正交试验对发酵培养基进行了优化。结果表明:菌株A1和A2隶属于紫色红曲菌(Monascus purpureus)。在基础培养基中,菌株A1和A2的MPs色价分别为3287.11、2561.30 U/g,洛伐他汀含量为31.35、33.74μg/mL。通过L_(16)(4^(5))正交试验优化培养基,获得产MPs最优配方为乳糖20 g/L、KNO_(3)5 g/L、KH_(2)PO_(4)4 g/L、KCl 2 g/L、Na_(3)C_(6)H_(5)O_(7)2 g/L,产洛伐他汀最优配方为乳糖20 g/L、KNO_(3)15 g/L、KH_(2)PO_(4)2 g/L、KCl 6 g/L、Na_(3)C_(6)H_(5)O_(7)4 g/L。在最优培养基中A1菌株总色价可达15851.98 U/g,提高了3.82倍,洛伐他汀含量为122.96μg/mL,提高了2.92倍;A2菌株总色价为8933.58 U/g,提高了2.49倍,洛伐他汀含量达198.26μg/mL,提高了4.88倍。该文为红曲菌资源库提供了优秀潜力菌株,为工业上大规模生产MPs和洛伐他汀奠定了理论基础并提供了实际方案。

红曲菌利用甘油产色素及莫纳可林K的动态过程探究

红曲色素(Monascus pigments,MPs)和莫纳可林K(Monacolin K,MK)是红曲菌(Monascus spp.)的主要次级代谢产物。有研究表明,甘油可促进红曲菌产MPs与MK,但作用机制不明确。采用分光光度法、液相色谱法及气相色谱法等分析甘油对红曲菌生长、产MPs及MK和甘油利用等的影响。结果表明,与对照相比,添加甘油后红曲菌发酵液的pH降低、生物量增加,红曲菌产MPs及MK的量均得到提升(p<0.05)。当培养基中甘油浓度分别为40 g/L和160 g/L时,甘油的利用率随着发酵时间的延长而提升,分别在12 d和15 d时甘油利用率达到最高。发酵过程中,甘油主要分布在胞外。随着发酵时间的推移,甘油在胞内的比率有所提升。该结果为利用甘油促进红曲菌产MPs及MK提供一定的理论和技术支撑。

红曲中红曲菌的鉴定及优质菌的筛选

红曲由红曲菌发酵而得,为提高红曲质量,需对红曲菌进行分离鉴定并筛选优质菌株,而当前红曲菌的鉴定方法和优质菌的筛选方法仍有不足。为此,本文在构建红曲菌菌株库的基础上,对比形态学鉴定和分子生物学鉴定对红曲菌物种鉴定的异同,通过相关性分析提出合理鉴定方案,同时对不同形态学分型的菌株测定色素和桔霉素产量,结合产量换算方法筛选出优质红曲菌。结果:单个红曲中可能存在多株形态不同的红曲菌,以44个红曲样本为菌源构建了45个不同形态学分型,共计148株红曲菌的菌株库。形态学分析表明多数红曲菌与紫色红曲菌、橙色红曲菌及丛毛红曲菌形态相似,而ITS rDNA测序和18S rDNA测序易将未知红曲菌匹配至紫色红曲菌、丛毛红曲菌和红色红曲菌。相关性分析表明ITS rDNA测序相比于18S rDNA测序更接近于形态学分析结果。由于ITS rDNA测序的基因对比库中可参照菌株的种类与数量较多,在多种鉴定方法存在结果差异时,建议优选ITS rDNA测序结果。最后同时参考色素产量、桔霉素产量、桔霉素产量与色素产量之比值3个指标筛选出高产色素(83.3 U/mL)和低产桔霉素(81.5 ng/mL)的菌株红曲菌MZT27,以黄色素与总色素的比值筛选出高产黄色素的菌株红曲菌MZT39(黄色素占比70.06%)。本文旨在为红曲霉种质资源的挖掘和红曲质量的提升提供借鉴。

红曲菌发酵产物及其在家禽生产中的应用研究进展

红曲菌发酵产生的多种代谢产物,具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗菌等功能。日粮中添加红曲菌发酵产物能显著提高家禽生产性能,降低肉、蛋中胆固醇含量。本文综述了红曲菌代谢产物的生物学功能及其在家禽生产中的应用现状,并提出红曲菌发酵产物作为饲料添加剂的使用规范。

温度对红色红曲菌M7液态发酵产monascin和ankaflavin的影响

为了提高红色红曲菌(Monascus ruber)M7发酵生产红曲素(monascin,MS)和红曲黄素(ankaflavin,AF)的产量,采用液态发酵法,探究不同发酵温度下其产生的醇溶性色素在组成和产量方面的变化规律.结果发现,当温度较低时(25、30℃),所产生的色素在470 nm有最大吸收,色调偏橙,红斑素(rubropunctatin,RP)和红曲红素(monascorubrin,MR)为优势组分;当温度较高时(35、40℃),所产生的色素在400 nm附近有最大吸收,色调偏黄,MS和AF成为优势组分.随着温度的升高,所有色素组分的产量均先升高后降低,其中,25、40℃不利于色素的产生,产量显著低于30、35℃;30℃时,RP和MR的产量达到最大值,分别为107、124 mg/L,而MS和AF的产量较低,分别为48、26 mg/L;35℃时,MS和AF的产量达到最大值,分别为100、47 mg/L,而RP和MR的产量相对30℃时显著降低,分别为57、50 mg/L.qPCR分析发现,温度对MS和AF液态发酵的影响与其对色素合成关键酶基因的转录调控密切相关,其中,对色素合成分支节点关键酶基因MrPigF和MrPigH的差异调节,可能对35℃时MS和AF产量的显著提高起到了较关键的作用.该结果可为提高MS和AF液态发酵产量提供参考.

红曲菌对黄羽肉鸡生长性能、免疫功能、血浆生化指标、抗氧化能力和脂质代谢的影响

本试验旨在研究红曲菌对黄羽肉鸡生长性能、免疫功能、血浆生化指标、抗氧化能力和脂质代谢的影响,为其在肉鸡饲养中的应用提供参考。选择288只1日龄且健康状况良好的麻黄肉鸡,随机分为2个组,每组6个重复,每个重复24只(公母各占1/2)。对照组饲喂基础饲粮,红曲菌组在基础饲粮中添加500 mg/kg红曲菌。试验期51 d。结果表明,与对照组相比:1)红曲菌组肉鸡22~42日龄和43~51日龄平均日增重显著升高(P<0.05),22~42日龄、43~51日龄和1~51日龄料重比显著降低(P<0.05)。2)红曲菌组肉鸡21和51日龄脾脏指数均显著升高(P<0.05)。3)红曲菌组肉鸡21日龄血浆总蛋白(TP)和总胆红素(TBILI)含量均显著升高(P<0.05),尿酸(UA)含量和谷草转氨酶(AST)活性均显著降低(P<0.05);红曲菌组肉鸡51日龄血浆TBILI和CRE含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性均显著升高(P<0.05),UA含量和谷丙转氨酶(ALT)活性均显著降低(P<0.05)。4)红曲菌组肉鸡21日龄空肠黏膜白细胞介素-1β(IL-1β)含量和51日龄空肠黏膜肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)含量均显著降低(P<0.05),21和51日龄空肠黏膜白细胞介素-10(IL-10)含量显著升高(P<0.05)。5)红曲菌组肉鸡肝脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均显著升高(P<0.05),肾脏丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05),肾脏GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。6)红曲菌组肉鸡21和51日龄血浆以及21日龄肝脏高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量显著降低(P<0.05),21日龄血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量显著降低(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加500 mg/kg红曲菌可提高1~51日龄黄羽肉鸡生长性能、免疫功能和抗氧化能力,同时调节脂质代谢。

橙色红曲菌Ku70基因缺失菌株的构建及功能分析

红曲菌作为传统的药食同源微生物,可产生多种有益的代谢产物,如:红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等。构建基因工程菌是研究红曲菌代谢途径的有效方法,同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)被认为是丝状真菌DNA双链断裂(DSB)修复的两种主要途径。有研究表明,抑制NHEJ中关键成分的活性通常会提高目的基因的同源重组效率。我们在橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)AS3.4384中发现了参与NHEJ途径的Ku70蛋白。通过农杆菌介导的同源重组法成功敲除Ku70基因,发现不影响红曲菌的生长繁殖\\产孢能力以及色素的生物合成,因此可构建Ku70基因缺失菌株作为红曲菌高效基因敲除体系,为后续的基因敲除提供研究材料。

红曲菌几种主要次级代谢产物及其生物活性的研究进展

红曲在我国古代也称"丹曲",传统的红曲是指以大米为原料,接种红曲菌经固态发酵而成的红曲米。红曲在中医上具有健脾化食、燥湿化痰、活血化瘀等功效;工业上常用于制作红曲米酒和腌渍肉、鱼等。红曲菌能产生多种次级代谢产物,例如红曲色素、莫纳可林K(MonacolinK,MK)、γ-氨基丁酸(GABA)、抗氧化物质、降血压物质等,其中部分代谢产物具有降血压、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性。本文介绍了近年来红曲菌几种主要次级代谢产物及其生物活性的研究进展。

产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响

经洛伐他汀(Monacolin K)抗性平板筛选和固态发酵实验验证,从红曲分离源中得到一株产洛伐他汀能力最强的菌株,并命名为M2-1,发酵12 d后其洛伐他汀产量可达1.472 mg/g(以干基计)。结合形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区序列分析,将其鉴定为红色红曲菌(Monascus ruber)。考察15种药食同源中药及其添加形式(药粉、药汁)对菌株M2-1固态发酵产洛伐他汀、色价等指标的影响,结果显示:陈皮粉、山楂粉、山楂汁、桑叶粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制备药红曲效果最佳(P<0.05),其中陈皮粉红曲和山楂汁红曲的洛伐他汀和色价最高,分别为2.118 mg/g和320.12 U/g,分别较普通红曲提高43.89%和71.79%。本研究发现多种中药能够促进红曲菌产洛伐他汀和红曲色素,为进一步提升传统红曲的药食两用功能提供了新的思路。

农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。

低桔霉素且产Monacolin K红曲菌株的筛选与鉴定

对福建古田地区不同来源的红曲样品进行分离纯化,结合固态发酵进行定向筛选,并通过菌落形态特征观察、分子生物学手段进行初步的分类鉴定.获得一株功能红曲菌株NW3-2,其固态发酵产品中桔霉素的含量低于国家有关有毒物质的最低检测标准,酸式和内酯式Monacolin K含量分别为3.20和2.47 mg·g-1.

产毒红曲菌中生物合成桔霉素基因--pksCT基因的保守性分析

选用7种14株产桔霉素红曲菌,运用基因组PCR分析方法,从它们的基因组中分别扩增到两条大小分别为669bp和591bp的pksCT基因翻译起始区部分序列和终止密码子区部分序列片段。扩增产物的测序结果通过NCBI进行BLAST同源性分析。结果显示扩增产物序列之间具有高度同源性,且分别与Genbank中公布的紫色红曲菌中pksCT基因翻译起始区部分序列和终止密码子区部分序列一致。pksCT基因是红曲菌中普遍存在的生物合成桔霉素基因。运用基因组PCR分析pksCT基因,是鉴别红曲菌产毒株的有效方法之一。

常压室温等离子诱变选育高产橙、黄色素红曲菌研究

为了提高红曲菌(Monascus sp.)产橙、黄色素的性能,采用新型的常压室温等离子体(ARTP)诱变技术处理红曲菌WM951孢子悬液。结果表明,最佳照射时间为90 s,此时红曲菌突变效果最好,其孢子致死率为78%,形态突变率为14.2%。试验最终从15株突变菌株筛选得到1株高产橙、黄色素的突变菌株WM951M1,对该菌株的发酵产物进行色价检测分析,发现该突变菌株产橙、黄色素能力比出发菌株分别提高136%、43%,30℃培养10d后其固态发酵红曲米中橙、黄色素色价最大值分别为3 620、3300 U·g-1。出发菌和突变菌所产色素的全波长扫面图谱显示,突变菌所产色素最大吸收峰出现在465nm处,并在410 nm处也有吸收峰,说明该菌主要合成橙、黄色素。在传代培养的过程中,该突变菌株表现出良好的遗传稳定性及形态稳定性,不仅可应用于生产橙、黄色素,也可用于生产色调偏橙型红曲米,还能丰富红曲菌菌株库资源。

不产桔霉素高产红曲色素的基因工程红曲菌株构建

以一株高产红曲色素的紫色红曲菌(Monascus purpureus)J01为研究对象,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA转化技术,敲除紫色红曲菌株J01基因组中的桔霉素合成关键基因pksCT,构建一株不产桔霉素高产红曲色素的红曲菌株。结果表明,通过菌落形态观察和生物量测定得出,菌株J42与菌株J01的菌落形态及生物量无显著性差异(P>0.05);经高效液相色谱(HPLC)与液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析得出,菌株J01的桔霉素含量为5.1 mg/kg,pksCT基因敲除菌株J42菌丝体中未检测到桔霉素;菌株J42的黄色素,橙色素和红色素色价分别为1 877 U/g、773 U/g、1 068 U/g,显著高于菌株J01(P<0.01),并且菌株J42的红曲色素总色价为415 U/mL,是原始菌株的1.56倍,成功构建了一株不产桔霉素高产红曲色素的生产菌株J42。

福建红曲中高产色素红曲菌的筛选及其诱变育种研究

福建省是中国盛产红曲的省份之一，其红曲品种多样。采用选择性培养基分离纯化福建各地区红曲米中的红曲菌，得到13株红曲菌纯菌株，分别命名M-1～M13。通过液态发酵和固态发酵相结合筛选得到1株高产色素的红曲菌M-3。经菌落形态特征观察、生理生化试验以及分子生物学鉴定手段，鉴定红曲菌M-3为高梁红曲菌（M．kaoliang）。通过工厂化固态发酵试验该菌株的色素产量高达5523U／g，出曲率为44％。采用物理化学复合诱变（紫外诱变和氯化锂诱变）的方法对出发菌株M-3进行了诱变选育，筛选得到1株色素高产突变菌M-3—7，且连续传接6代色素产量稳定，三角瓶固态发酵色价保持在9500U／g左右。将其应用于工厂化固态发酵，结果表明色素高产突变菌M-3—7的色素产量高达6400U／g，比原菌高出15．9％，高于国内外报道的其他色素高产菌株的固态发酵生产水平。研究结果为我国红曲菌资源的整合以及红曲色素的工厂化大规模发酵生产奠定了前期基础。

橙色红曲菌As3.4384及其诱变体发酵产物中的桔霉素和色素的高效液相色谱研究

对橙色红曲菌As3.4384及其诱变菌株大米固态发酵物中桔霉素和色素的HPLC分离进行了优化,采用Symmetry C18(250mm×4.6mmi.d.,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(磷酸调pH3.0,77∶23,V/V),分别采用紫外检测器(UV=254nm)、荧光检测器(λex=331nm,λem=500nm)及两者串联对桔霉素和色素进行了监测。通过ESI-MS对色素进行了鉴定,并测定了经橙色红曲菌As3.4384及其诱变菌株于30℃发酵14d后的大米、糯米、小黄米、燕麦米和红米中桔霉素含量。结果表明:ESI-MS鉴定的两种色素分别为红曲菌素和红曲黄素,橙色红曲菌As3.4384发酵后的大米、糯米、小黄米、燕麦米和红米中桔霉素含量分别为151.4、100.5、5.06、80.5和150.5mg/kg,而诱变菌株发酵后的大米、糯米、小黄米、燕麦米和红米中桔霉素含量分别为0.218、3.86、0.223、2.45和4.05mg/kg。