表达K_88K_99双纤毛抗原及K_99纤毛抗原的产肠毒素大肠杆菌的构建

应用转化法:将带有K_99纤毛抗原的重组质粒PHK_99分别转化到具有K_88纤毛抗原的产肠毒素菌株B_6(O_149K_91K_(68)ac)“和不具K_88抗原的产肠毒素菌株(O_14K_85),获得了35株抗氨苄青霉素的转化子。在这35个转化子中,有32个能同时表达K_(88)、K_(99)两种纤毛抗原,有3株能表达K_(99)纤毛抗原。这些转化子仍具有产肠毒素的特性。

仔猪大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝检测方法的建立与应用

为建立大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断和定量检测方法,用纯化的大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原免疫家兔制备阳性血清,其琼扩效价分别达到1∶32、1∶32、1∶128;利用该阳性血清IgG致敏醛化的绵羊红细胞,确定了最适K88、K99、987P阳性血清IgG的质量浓度分别为40、160、80μg/mL。用该方法对同一批次的K88、K99和987P纤毛抗原进行3次检测,K88、K99和987P纤毛样品的RIHA效价均为1∶1 600、1∶1 600和1∶800。结果表明,该检测方法具有较好的特异性和可重复性,可用于大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断。

肠毒素性大肠杆菌CS3纤毛抗原在痢疾菌中的表达及其免疫效果研究

首先通过体内外重组的方法,构建了福氏2a痢疾菌T32asd基因缺陷的突变体FaD,作为抗原载体菌;同时,构建包含asd基因的表达质粒pYX102,与FaD一起,构成宿主-载体平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因.将肠毒素性大肠杆菌的CS3菌毛抗原基因克隆至pYX102,构建成重组表达质粒pYX103,ELISA检测结果证实CS3在痢疾菌中可以很好地表达.免疫小鼠后可诱生相应的抗体,虽然口服免疫和注射免疫产生的CS3抗体效价有一定差别,但对痢疾菌的毒株攻击均可提供较好保护.该结果为细菌性腹泻疫苗的研制提供了候选株.

大肠杆菌K_(88)纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5%绵羊血改良M inca琼脂筛选和克隆表达良好的K88+菌株,改良M inca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提,用Sepha-rose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS-PAGE电泳测定其分子量约为25 000,且仅此一条蛋白带;与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株,不凝集K99,987P或F41菌株;在琼扩试验中,只与K88粗提抗原出现一条沉淀线,且效价为1∶64,而不与K99,987P抗原出现沉淀线;在免疫电泳试验中,与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明,所制备的K88血清特异性强、效价高,可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验,对K88菌株进行鉴定,对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。

检验用大肠杆菌K88纤毛抗原的纯化及其单因子血清制备与质量控制方法研究

为研究兽用生物制品检验用大肠杆菌K88纤毛抗原的纯化及其单因子血清制备与质量控制方法。通过生物反应器发酵含K88抗原的大肠杆菌,机械脱纤处理获得K88纤毛抗原,经柠檬酸等电点沉淀和饱和硫酸铵梯度盐析以及透析处理纯化抗原,免疫家兔3次制备单因子血清并进行质量控制。结果显示,所纯化的K88纤毛抗原纯度能达到85%,每升发酵菌液可得到提纯抗原33.3 mg,免疫家兔血清琼扩效价可达到1∶128。表明该纤毛抗原制备和纯化及其单因子血清制备方法简易,纯度和产率较高,质量可控且易于批量制备。

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

定居因子抗原(CFA)是肠毒素大肠杆菌(ETEC)的重要毒性因子和保护性抗原,大多以菌毛的形式存在。此类抗原的表达及菌毛的装配需要2类基因的共同作用,即亚基结构基因和辅助蛋白结构基因。亚基是纤毛抗原的基本组成单位,而辅助蛋白则参与亚基蛋白分子的输送及装配过程。CS3亚基结构基因位于辅助蛋白结构基因的下游,处于CS3操纵子的3′端。CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析揭示。

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因和产毒大肠杆菌纤毛抗原基因的联合表达

目的：编码日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌纤毛抗原Ｋ９９基因的联合表达。方法：ＰＣＲ扩增的Ｋ９９基因克隆入ｐＵＣ１８载体，再将限制性酶切获得的ＧＳＴ基因克隆入ｐＵＣ１８－Ｋ９９重组质粒。限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳选择连接方向正确的重组质粒用于重组蛋白的表达。共表达产物采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ、反向ＩＨＡ、ＥＬＩＳＡ和透视电镜观察进行分析鉴定。结果：共表达产物的分子量约５０ｋＤａ，存在于宿主菌体表面的纤毛中，ＧＳＴ抗血清和Ｋ９９抗血清均可识别共表达产物，提示共表达产物既有ＧＳＴ表位，又有Ｋ９９抗原表位。结论：日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌Ｋ９９基因共表达获得成功。

大肠杆菌K88ac、K99和987P纤毛抗原的纯化及抗血清的制备

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是新生畜(仔猪、羔羊和犊牛)腹泻的主要病因之一,其致病因子包括纤毛抗原和肠毒素。我们参照国外学者De Graaf和Isaacson等人的方法分别纯化了K88ac、K99和987P三种纤毛抗原并制备出三种高特异性抗血清。纯化用K88菌株C83549(0149:K91,K88ac),K99菌株C83644(0101:K99),987P菌株C83710(020:987P)均由中国兽医药品监察所提供。K88菌用改良Minca培养基,K99菌用Minca培养基,987P用胰酶水解大豆酪蛋白胨肉汤培养基。

大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原提纯及抗血清制备

采用加热法和盐析法对大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原进行了提取、纯化,并通过SDS-PAGE凝胶电泳对提纯效果进行了检验。将纯化的纤毛抗原免疫家兔,制备了K88、K99、987P纤毛抗原抗血清,用琼脂扩散试验检测了抗血清的效价。结果表明,纯化的K88、K99、987P纤毛为高纯度的纤毛抗原,其分子量分别约为26、18、20 kD。K88、K99、987P抗血清的琼扩效价依次为1∶32、1∶32、1∶128,且特异性高。本研究为K88、K99、987P纤毛抗原定量检测及产纤毛大肠杆菌菌株的鉴定奠定了基础。

E.coli纤毛抗原K_(99)菌株电子显微镜观察试验

肠致病性埃希氏大肠杆菌(E.co1i)的粘附因子K_(99)抗原,是一种易热蛋白质,从形态上看是一种纤毛结构,这种纤毛可以粘附于小肠上皮细胞,使细菌在小肠中聚集产生肠毒素而致病。这种纤毛的致病作用越来越引起人们的重视,在兽医研究方面,现已发现猪的肠致病性大肠杆菌带有K_(88)、K_(99)和987P三种纤毛抗原。

K_(99)—F_(41)双纤毛菌的构建

产肠毒素大肠杆菌能引起仔猪、犊牛、羔羊等新生幼畜发生急性腹泻、K_(99)和F_(41)是这类产肠毒素大肠杆菌所产生的两种在免疫性质上不同的纤毛抗原。 提取K_(99)质粒,用HindⅢ酶消化,再用低熔点琼脂糖电泳回收分子量约为11Md的K_(99)的HindⅢ片段,并将该片段与经过碱性磷酸酶处理的PBR322载体重组,转化大肠杆菌C_(600)。用ELISA筛选K_(99)抗原阳性克隆。 E.coli83919F_(41)^+是非致病的产生F_(41)纤毛抗原的野生菌株。且F_(41)抗原基因是由染色体编码的。采用转化的方法将K99人工重组质粒转化到E.coli83919F_(41)^+中构建成K_(99)—F_(41)双纤毛基因工程菌。双纤毛菌中K_(99)抗原表达达到给体菌的水平,而F_(41)抗原的表达未受到明显的干扰。

通过饲喂特异性卵黄抗体控制猪肠道疾病

免疫鸡的蛋黄是丰富的低成本多克隆抗体的来源之一。相对于少量保守的哺乳动物蛋白,卵黄抗体更易引发持续的免疫反应,一个鸡蛋可以收获超过100 mg的特异抗体。口服鸡卵黄抗体可以用来和动物的传染性腹泻病原产生免疫反应。因此,这些抗体在实际生产中可以用来控制某些由病原微生物引起的肠道疾病,尤其是对于早期断奶仔猪。在我们实验室,我们用本地采集的ETEC K88+毒株的纤毛抗原免疫鸡群以获得抗体,同时用该毒株分别给3日龄和14日龄的仔猪进行攻毒。饲喂含ETEC抗体卵黄粉的猪产生短暂的腹泻,几乎全部存活,且存活猪的增重良好。而只饲喂不含特异抗体普通蛋黄粉的对照组猪群产生了严重的腹泻、脱水、失重,部分猪在48 h内死亡。抗体处理过的猪没有ETEC K88+的病原排出。

仔猪腹泻性大肠杆菌病

腹泻是仔猪最常见的疾病,产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)已证实是仔猪腹泻的最主要病原之一。哺乳仔猪腹泻病原的调查,由 ETEC 引起的美国占48%,(Bergland,1980),瑞典占74.2%(Soderlend,1988),日本(1987)占41.9%。在我国,江苏占68.9%(崔治中,1980),四川占59.2%(何明清,1988),我们对广西调查结果表明,ETEC 是引起腹泻病的主要病原,占30%以上。

仔猪黄痢的病原学研究

仔猪黄痢是由病原性大肠杆菌引起的初生仔猪的一种急性、高度致死性传染病,本病多发于1周龄以内的仔猪,以1～5日龄最为常见。一窝仔猪中发病率可达90%以上,病死率也很高,有的全窝死亡;不死的仔猪也须经较长时间才能恢复,因此,严重威胁着养猪事业的发展。鉴于本病对养猪生产的危害性,许多学者对此作了大量的研究,特别是对于仔猪黄痢的病原学研究近年来进展较快。

毒素源性大肠杆菌CFA/I、CS_3重组菌株的粘附力、免疫原性和保护性的研究

本研究采用可逆性肠结扎成兔腹泻(RITARD)动物模型检测了毒素源性大肠杆菌(ETEC)定居因子抗原Ⅰ(CFA/Ⅰ)和表面抗原3(CS_3)重组菌株的肠道粘附力、免疫原性和保护性。经肠道及口服接种时重组菌株对肠道均有较强的粘附力,与CFAs阴性宿主菌相比P<0.01。口服免疫家兔时,第四周血清抗体滴度达到高峰,分别为1∶9 000和1∶80 000;肠道免疫家兔后血清效价在第二周达到高峰,滴度分别为1∶8 000和1∶60 000。在抗体滴度高峰时进行ETEC野生株攻毒,结果显示口服组抗腹泻保护率为66.7％～75％,肠道组为50.1％～71.4％。攻毒后免疫家兔的排菌天数较对照组明显减少。

日本申请引进单克隆抗体动物药剂

盐野义制药公司申请引进仔牛腹泻预防药“K99单克隆抗体“NP””。这将是日本引进的第一种单克隆抗体动物药剂。仔牛腹泻是仔牛出生后3天内容易感染的由大肠杆菌引起的一种疾病。在日本,有2％的仔牛会发生这种病,80％的发病仔牛会死亡。“K99”是美国Molecular Genetics公司开发的,已将制造销售权转让给美国Upjhon公司。盐野义制药公司就是从Upjhon公司引进的。用99”开发的这种小鼠单克隆抗体能与毒性大肠杆菌的纤毛抗原K99结合。生后12小时内给仔牛饮用。用纤毛阻止毒性大肠杆菌附着在仔牛的肠道上。

鸡蛋抗体生产技术提供给Lohmann公司在欧洲作为饲料添加物销售

基因公司宣布把抗原免疫鸡生产鸡蛋抗体(IgG类型)的技术提供给德国Lohmann公司,Lohmann公司在欧洲作为饲料添加物登记鸡蛋抗体,从1995年6月商业化。作为饲料添加物实用化鸡蛋抗体还是世界首创。 基因公司90年6月把在欧洲及美国的生产、商业化权提供给Lohmann公司。

用“鸡蛋抗体”治疗家畜腹泻

岐阜免疫研究所从免疫的鸡生出的蛋中获得抗体IgG的"鸡蛋抗体",可用来开发猪和牛的腹泻治疗药.正在建厂的生产规模是每天生产按kg计算的粗IgG类,计划1991年利用这种制剂先用猪进行野外试验.作为新的抗体生产手段,鸡有了新的用途.King酿造公司这月已销售了用鸡蛋制造的抗体.

仔猪大肠杆菌腹泻三价 灭活疫苗和止痢口服液防治黄、白痢效果观察

仔猪黄、白痢在我市每年都有不同程度的发生,据调查辉县市各养猪场及群众散养的母猪,近几年来仔猪黄、白痢的发病率达50％—80％左右,仔猪黄痢的死亡率达50％—100％,若防治不及时可造成严重的经济损失。了为减少仔猪黄、白痢的发生,保证仔猪正常发育,增加经济效益,我们于1991年以来应用农业部中国兽药监察新生产的仔猪大肠杆菌腹泻K88、K99。