人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

【目的】通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5(K5)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用。【方法】采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析。【结果】在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为(4.57±0.79)g和(1.15±0.31)g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为(15.75±9.79)个和(6.60±3.39)个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少。【结论】人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移。

人纤溶酶原K5基因的结构改造及其在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的改造人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因,构建RGDRGD-liteK5融合表达质粒,并表达纯化所得RGDRGD-liteK5蛋白。方法以人纤溶酶原K5 cDNA为模板,通过PCR得到RGDRGD-liteK5基因片段,并克隆到质粒pGEX1-λT中,构建重组原核融合表达载体pGEX-RGDRGD-liteK5;在IPTG诱导下,观察融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中的表达情况;利用亲合层析柱纯化表达产物,用Western blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增得到274 bp的片段,并成功插入pGEX1-λT质粒;含重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,其分子量为36 kD;获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量约为10 kD的RGDRGD-liteK5蛋白;Western blot证实了表达产物的正确性。结论成功地改造了人纤溶酶原K5基因,构建了重组融合表达质粒pGEX-RGDRGD-liteK5,并纯化了其表达产物。

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体(mK5)在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数:抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度,同时固定其它参数。通过电泳分析,获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件;组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白,SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白;MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞(HRCEC)增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为:最适细菌培养温度为37℃,最佳抗生素浓度为50μg/mL羧苄青霉素,最适pH值为7.0,在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG为最佳诱导条件,37℃诱导10h为最佳诱导时间;优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg/L,产量较优化前(15mg/L)提高近30%;mK5特异性地抑制HRCEC的增殖,IC50=40nmol/L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数,并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白,为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。

人纤溶酶原K5联合化疗和放疗对小鼠S180实体瘤的抑制作用

目的观察人纤溶酶原K5联合化学及放射治疗对小鼠S180实体瘤的抑制作用。方法将小鼠随机分为7组,阴性对照组、化疗组/放疗组、艾迪组+化疗组/甘氨双唑钠+放疗组、化疗/放疗+K5大剂量组、化疗/放疗+K5中剂量组、化疗/放疗+K5小剂量组及K5中剂量组,连续给药10d,观测肿瘤的大小,计算抑瘤率。结果 K5联合化学治疗可以明显增强其抑制肿瘤生长的效果,并有一定的剂量依赖性,而K5联合放射治疗可以增强其抑制肿瘤生长的效果。结论 K5可能为一种新型的治疗肿瘤的药物,但是K5与化学及放射联合治疗的具体机制尚待进一步研究。