鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LX4纤突蛋白基因分子特征

应用RT PCR方法分别扩增了中国地方分离株IBVLX4S1和S2基因并进行了基因的克隆和序列测定。结果发现 ,LX4S基因由 3495个核苷酸组成 ,编码一条 1 1 6 4个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由 5 39和 6 2 5个氨基酸残基组成。LX4S基因推导氨基酸切割识别位点序列为HRRRR ,与A2、SD/ 97/ 0 2和Z株相同 ,而与其它国内外参考毒株不同。与国内外 1 0株已报道的具有全S基因序列的IBV参考毒株比较 ,LX4与国内分离毒株SD/ 97/ 0 2的核苷酸和氨基酸同源性最高。与 32株国内外参考毒株的S1基因进化树分析比较表明 ,LX4与A2、SD/ 97/ 0 2、Z、TJ/ 96 / 0 2、JX/ 99/ 0 1和SAIBWJ等 7个国内分离株在同一亚群内。在该亚群内 ,LX4与A2和SD/ 97/ 0 2亲缘关系更近 ,且三者在高变区和抗原表位均具有高度的同源性 ,而与本亚群内其它参考毒株对应的高变区和抗原表位同源性差异较大。LX4与H1 2 0S1基因编码氨基酸的同源性虽然高于其它国外参考毒株 ,但同源性仍然较低 ,为 75 %。与参考毒株比较 ,LX4S2基因的点突变造成其推导的氨基酸序列有 1 1个位点发生改变 ,这些突变可能影响S2与S1蛋白之间的相互作用 。

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBVBeaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT-PCR,成功地扩增出IBVH株S1基因。扩增产物经BstYⅠ、HaeⅢ和PstⅠ酶切分析,结果表明,IBVH株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBVH株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM-T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97.39%和97.27%。将IBVH株S1基因亚克隆到pPICZ-A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS-PAGE实验证实了IBVH株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测,证实了表达产物的抗原特异性。

犬冠状病毒的分离鉴定及其纤突蛋白基因的克隆与序列比较

以犬胎原代细胞，采用同步接种、带毒传代和添加新细胞的方法，从１例腹泻犬脾脏和１例临床健康犬肠内容物中分离出２株犬冠状病毒（ＣＣＶＹＳ１，ＣＣＶＣＩ１）。该２株病毒可使ＣＲＦＫ细胞出现典型的细胞融合病变，与从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株形成的细胞病变相似；电镜负染和超薄切片观察，分离毒株细胞培养物中均含有典型的冠状病毒粒子，并形成胞浆内包涵体；经理化学、生物学鉴定，具有ＣＣＶ的特性；间接免疫荧光试验鉴定，证明为ＣＣＶ；动物回归试验证明，ＣＣＶＹＳ１毒力较强，ＣＣＶＣＩ１毒力较弱。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，分别扩增了ＣＣＶＮＬ－１８、ＣＣＶＹＳ１和ＣＣＶＣＩ１株纤突蛋白（Ｓ）主要功能区基因片段，经克隆、序列测定、计算机比较核苷酸和推导的氨基酸序列，结果为：（１）ＣＣＶＹＳ１和ＣＣＶＣＩ１与国外发表的Ｋ３７８等５株ＣＣＶ和ＣＣＶＭＬ－１８株的同源性为９１．７％～９９．４％和９２．０％～９９．４％，而与ＴＧＥＶ和ＦＩＰＶ的同源性为９０．２％和８８．０％～９０．０％；Ａｂ抗原亚位点与ＣＣＶ相同，不同于ＴＧＥＶ和ＦＩＰＶ，进一步证明本研究分离的病毒为ＣＣＶ；（２）ＣＣＶＹＳ１、ＣＣＶＣＩ１株与Ｋ３７８等ＣＣＶ强毒株同源?

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LH2/01/10纤突蛋白基因的遗传变异

对传染性支气管炎病毒LH2/01/10的S1和S2基因分别进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明,其S基因由3 495个核苷酸组成,编码的多肽由1 164个氨基酸残基组成。S蛋白的切割识别位点氨基酸组成为组氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(HRRRR)。推测其裂解后形成的S1和S2亚单位中,S1由539个氨基酸残基组成,S2由625个氨基酸残基组成。序列分析发现:LH2/01/10与Beau、M41、CU-T2、D1466、DE072、Holte、Gray、Ark99、Conn、H52、KB8523、SD/97/02、ZJ971和LX4毒株S基因推导的氨基酸同源性在63%～96%之间。其中与国内分离毒株SD/97/02和LX4氨基酸的同源性均在95%以上,三者切割识别位点也相同。但与另一国内分离株ZJ971氨基酸的同源性仅为75%,而与国外毒株之间在83%以下。切割识别位点也与ZJ971和所选的国外参考毒株代表性的RRF/SRR位点不同。与这些参考毒株相比,LH2/01/10 S基因在76～78位缺失TCT碱基,在67～69位插入TCT碱基,105位和549位氨的基酸发生点突变。总体来看, SD/97/02的S1基因推导的氨基酸序列与国内外已报道的42株参考毒株同源性较低,在52%～96%之间。与国内分离毒株亲缘关系相对较近,其中与国内近年来不同地区分离的A2、LX4、SD/97/02、TJ/96/02、JX/99/01。

杆状病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其抗原性分析

本研究构建了SARS冠状病毒纤突蛋白(S)重组杆状病毒(rBac-SS)。SDS-PAGE及Western-Blot分析表明约190 Ku左右的重组SARS纤突蛋白(rSS)在rBac-SS感染sf9昆虫细胞获得表达,并具有特异免疫反应原性。以rBac-SS感染的昆虫细胞裂解物稀释后直接包被ELISA板,与Vero细胞培养的全病毒裂解物比较,检测SARS-CoV康复病人血清特异抗体,表现出同样的敏感性和特异性;rBac-SS感染的昆虫细胞用于间接免疫荧光,快速检测血清特异抗体反应,具有良好的敏感性和特异性。结果显示,杆状病毒表达的rSS有望替代SARS-CoV全病毒,作为安全、敏感和特异的重组诊断抗原,并为探索重组亚单位疫苗的可行性奠定基础。

猪源冠状病毒TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析

以猪源冠状病毒(Porcine coronavirus)TGEV纤突蛋白基因序列为基础,利用生物软件对TGEV中国分离株纤突蛋白进行N-糖基化位点、跨膜螺旋、进化树、二级结构及抗原位点的预测和分析。结果显示所有TGEV毒株可分为3个基因型,4株中国分离株分别归属于以上3个基因型,属于Ⅰ型的中国株TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上与其他中国株有明显的差异,而同属于Ⅲ型中国毒株SC-Y和TH-98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上非常接近,而所有中国分离株抗原表位没有明显差别,表明TGEV在中国没有显著的变异。

犬腺病毒纤突蛋白基因功能区的比较分析

根据GenBank中已发表的CAV纤突基因序列 ,设计合成 4对 8条引物 ,用已建立的PCR方法 ,对犬 2型腺病毒沈阳分离株第 5代强毒经蚀斑克隆驯化的第 6 0代毒弱毒 (SY_V6 0 )和犬 1型腺病毒长春犬株 (CCC_V6 )的纤突基因进行了扩增 ,PCR产物经纯化后进行基因序列测定 ,测定结果经拼接后得到一个由 16 32和 16 2 9个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列 ,分别编码 5 43和 5 42个氨基酸。犬 2型腺病毒 (SY_V6 0 )与犬 1型腺病毒 (CCC_V6 )的纤突基因的同源性达到 80 .48%。犬 2型腺病毒(SY_V6 0 )与犬 1型腺病毒 (CCC_V6 )纤突基因的同源性达到 80 .48% ;根据犬的腺病毒与人 2型腺病毒纤突蛋白的序列同源性比较结果 ,推测了犬腺病毒纤突蛋白的尾 (tail)、轴 (shaft,)、结 (knob)三个功能区的氨基酸序列 ,2个型之间的尾区同源性为 76 .9% ;轴区同源性为 78.5 9% ;其结区同源性为 83.2 4% ,而同型毒株之间结和尾区同源性较高 。

血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

研究首先对血清8型禽腺病毒(FAd V-8)的纤突蛋白基因F进行了克隆并分别构建了原核表达载体和真核表达载体,经测序验证后分别命名为p GEX-6P-1-F和pc DNA3.1-F。将原核表达质粒pGEX-6P-1-F转化BL21,经IPTG诱导,获得了FAd V-8 F蛋白的GST-F可溶性融合表达产物。将纯化的GST-F蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗FAd V-8 F蛋白的多克隆抗体。Western blot结果证明,制备的抗FAd V-8 F蛋白的多克隆抗体能特异性地识别转染pc DNA3.1-F或感染FAd V-8病毒细胞中57 ku大小的蛋白条带。间接免疫荧光试验同样证明,抗FAd V-8的F蛋白的多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。研究结果为进一步建立FAd V-8快速血清学诊断方法、亚单位疫苗研制及探究纤突蛋白F在病毒感染致病中作用奠定了基础。

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR和重组PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)TSX毒株纤突蛋白(spike protein,S)基因全长cDNA序列,分离纯化PCR产物,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pGEM-S,并对其进行酶切鉴定和测序,对测序结果及推导氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,S基因全长为4 350 bp(GenBank登录号DQ001167),编码1 449个氨基酸,N端前16个氨基酸为推测的信号肽序列,其后1 433个氨基酸构成成熟蛋白;与GenBank中已发表的9个TGEV毒株S基因进行比较,核苷酸序列同源性为95%～98%,推导的氨基酸序列同源性为95%～98%。基于S基因及其推导氨基酸序列的聚类分析表明,TSX株与Miller、T014、TS和HN2002株亲缘关系较近。S基因变异是由于碱基突变造成10处氨基酸发生改变,但主要抗原部位未发生任何变异,为进一步研制猪传染性胃肠炎基因疫苗提供了良好的候选基因。

重组痘病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其免疫原性分析

对牛痘病毒弱毒株表达的SARS冠状病毒纤突蛋白(Spike protein,S)的免疫原性进行分析与比较。以减毒痘病毒(WR株)为载体重组了SARS冠状病毒全长S基因(rWR-SARS-S)。SDS-PAGE和Western blot试验表明,迁移率约为190kD的重组SARS S蛋白可在HeLa细胞中表达,而且可以被鸡抗SARS全病毒高免血清识别,具有特异免疫反应原性。进一步研究表明,rWR-SARS-S感染的细胞在IFA试验中可与鸡抗SARS的高免血清发生特异反应,具有良好的敏感性和特异性。以104PFU的rWR-SARS-S免疫BALB/c小鼠产生的抗体在间接ELISA试验中可以被S蛋白识别,产生特异抗原抗体反应。利用痘病毒表达的SARS冠状病毒S蛋白具有良好的抗原性和生物学活性,可替代SARS冠状病毒全病毒,为研究安全、敏感和特异的重组诊断抗原奠定了重要基础。

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白的研究进展

本文对禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）纤突蛋白的形态、结构、免疫学活性、血凝活性、与病毒血清型的关系，尤其是其分子生物学研究的新近进展进行了综述，以期对ＩＢＶ基因工程疫苗的制备及疾病的快速诊断和防治打下基础。

鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因的遗传变异分析

对鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因进行了RT—PCR扩增、克隆和测序。结果表明，PSH株S基因由3504个核苷酸组成，编码1条由1167个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由541和626个氨基酸残基组成。PSH株S蛋白切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸（RRFRR），与多数鸡传染性支气管炎病毒（IBV）切割识别位点相似（RRF／SRR）。与GenBank中其他冠状病毒毒株S基因的推导氨基酸序列相比较，PSH株与IBV参考毒株的同源性为79．3％～99．6％，而与其他冠状病毒包括火鸡蓝冠病病毒和SARS病毒的同源性均小于37．8％。表明，鸽源冠状病毒PSH株属于第3抗原群冠状病毒，且与IBV亲缘关系较近。

犬冠状病毒纤突蛋白基因的序列测定与比较分析

将两株犬冠状病毒国内分离毒CCVYS1、CCVCI1接种于CCV中和抗体效价低于 1∶4的 2月龄幼犬 ,观察接种犬临床表现、体温和剖检变化。结果表明 ,CCVYS1株毒力较强 ,CCVCI1株毒力较弱。采用RT_PCR方法扩增出两株病毒部分S基因序列 ,克隆于pUC1 9SmaI位点或pGEM_T载体中 ,以双脱氧末端终止法测定插入质粒的cDNA核苷酸序列。用PROSIS计算机软件推导氨基酸序列 ,并与从Genbank上查到的CCV、TGEV和FIPV相应氨基酸序列进行多重比较。分别推测 ,CCVS蛋白上Ac抗原位点的氨基酸残基可能是影响病毒毒力的因素之一。

犬2型腺病毒毒株纤突蛋白基因的比较分析

根据 Gen Bank中犬腺病毒 (canine adenovirus,CAV)纤突基因序列 ,设计合成 2对引物。用 PCR方法 ,对犬 2型腺病毒沈阳分离株 (CAV- 2 SY株 )第 5代强毒 (SY- V5 )、经蚀斑克隆驯化的第 6 0代毒弱毒 (SY- V6 0 )、SY- V6 0在易感犬体上传 5代的回收毒 (SY- CP5 )、美国疫苗毒 (U S- V2 0 )等 4个毒株的纤突基因进行了扩增 ,PCR产物经纯化后进行基因序列测定 ,测序结果经拼接后得到了 1个由 16 2 9个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列 ,编码 5 43个氨基酸。犬2型腺病毒与 Gen Bank中的标准的 CAV- 2强毒株 (Toronto A2 6 / 6 1)纤突蛋白基因序列的比较结果表明 :CAV- 2 SY株强毒株与 Toronto A2 6 / 6 1株相同 ;SY- V6 0株与 SY- CP5相同 ;与驯化前的 SY- V5相比 ,在 1134位发生碱基颠换 ,编码的氨基酸由原来的天冬酰氨 (N)变为赖氨酸 (K) ,并导致 N- X- S/ T潜在糖基化位点发生改变 ,US- V2 0该部位也发生同样的突变 ,本试验测定和比较的 CAV- 2强毒株有 5个潜在的 N-联糖基化位点 ,弱毒株仅有 4个位点 ;U S- V2 0与 Toronto A2 6 / 6 1差异较大 ,有 11个碱基发生变化 ,导致 8个氨基酸的变异。

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

根据已发表的ＣＡＶ纤突基因序列，用ＰＣＲ方法，对４个ＣＡＶ－２毒 株和４个ＣＡＶ－１毒株的纤突基因进行了扩增和测序，测定的核苷酸序列经推导得到分别编 码５４３和５４２个氨基酸的ＣＡＶ纤突蛋白全序列。测定的ＣＡＶ－２比较表明：我国流行的ＣＡＶ－２ ＳＹ 强毒株与国外标准强毒株Ｔｏｒｏｎｔｏ Ａ２６／６１株相同，其驯化致弱的毒株与驯化前相比在１１３４位 发生碱基颠换。测定的ＣＡＶ－１比较表明：我国流行的ＣＡＶ－１株与标准强毒ＲＩ２６１株差异相对 较大，而国内ＣＡＶ－１毒株互相之间相对差别较小。ＣＡＶ－２与ＣＡＶ－１纤突基因的同源性为８０．４８％。

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析(英文)

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株S基因相比,S基因核苷酸序列同源性在40.2%～99.5%之间;推导的氨基酸序列同源性在15.9%～99.0%之间。DXMV株S基因变异区主要集中在该基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区却十分保守。基于S全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株S蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。

犬冠状病毒V1株纤突蛋白全基因克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株纤突蛋白(S)基因进行了克隆和测序。根据GenBank中报道的CCVV54株S基因序列,设计了一对特异性引物,对CCVV1野毒株S基因进行了RT-PCR扩增。将扩增得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T中得到重组质粒pTS,用于序列测定。结果该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。将V1株S全基因与GenBank中已发表的6个CCV毒株S基因进行了比较,结果核苷酸序列同源性在91.0%～99.0%之间;推导的氨基酸序列同源性在93.0%～99.0%之间;同时发现CCV变异区主要集中在S基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区碱基却十分保守。基于S全基因聚类分析结果表明,S基因分型结果与CCV毒力强弱并不一致;V1野毒株推导的S蛋白潜在的N-联糖基化位点与CCVV54强毒相同,均为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点是多数强毒拥有而弱毒Insavc-1没有的。推导的V1株S蛋白疏水性及抗原表位与Insavc-1株有一定的差异,这些差别对病毒致病性和免疫原性等影响需进一步的研究。

转基因玉米表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白免疫原性鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(TGEV-S)在转基因玉米中的表达及对试验小鼠的免疫原性,本试验在前期TGEV-S转基因玉米植株构建成功的基础上,自玉米叶片中抽提可溶性蛋白作为包被抗原,建立筛选表达TGEV-S转基因玉米的间接ELISA检测方法。结果显示在92份被检测植株中8株为阳性,取阳性值较高的2株152-3和156-6,提取叶片可溶性蛋白,与弗氏佐剂乳化后皮下注射免疫小鼠,只有植株156-6中可溶性蛋白免疫小鼠可产生针对TGEV的抗体,而152-3免疫组检测结果为阴性。利用156-6植株叶片对小鼠进行灌胃免疫,也可产生针对TGEV的特异性抗体。以上结果表明,获得的TGEV-S转基因玉米植株不但可表达TGEV-S蛋白,而且该蛋白通过注射或口服途径免疫小鼠后均可产生针对TGEV-S的特异性抗体,提示TGEV-S转基因玉米具有发展成为TGEV口服疫苗的潜力。

抗禽腺病毒4型纤突蛋白-2的卵黄抗体的治疗效果评估

目的为研究防治禽腺病毒4型(fowl adenovirus type 4,FADV-4)的卵黄抗体的治疗效力。方法利用FADV-4纤突蛋白-2(fiber-2)亚单位疫苗对蛋鸡进行免疫,制备和纯化抗FADV-4 fiber-2的卵黄抗体后,评估该卵黄抗体不同治疗剂量、不同治疗时机对FADV-4的治疗效果。结果Fiber-2亚单位疫苗中fiber-2蛋白的空间结构预测为同源三聚体;利用该疫苗制备的卵黄抗体可用水稀释法和PEG-4000沉淀法得到初步纯化,其抗体效价可达10^(5.597)。卵黄抗体的治疗试验表明,在FADV-4感染后1 d内进行卵黄抗体治疗,鸡的存活率为100%,治愈率超过90%,且高剂量抗体治疗效果要优于低剂量;而在FADV-4感染后两天进行抗体治疗,鸡的存活率为70%,治愈率为50%,能够显著改善攻毒后的临床症状,延长鸡的存活时间,降低死亡率。结论制备的抗fiber-2卵黄抗体可以有效治疗FADV-4的感染。