表达H120 S基因膜外区段的重组鸡传染性支气管炎病毒的拯救

为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,构建了含有上述区段的重组IBV cDNA克隆BeauR-H120(S1)。然后直接将BeauR-H120(S1)作为DNA模板在体外转录出病毒基因组RNA,该转录产物电转入Vero细胞后48h收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得一株重组IBV(rBeau-H120(S1))。通过RT-PCR方法证明rBeauH120(S1)基因组中包含有完整的H120纤突基因膜外区段。Western-blot试验证实rBeau-H120(S1)的N蛋白有表达,表明重组病毒在Vero细胞内进行了增殖。经连续传代后测定rBeau-H120(S1)的TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22 TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度为106.13±0.23EID50/mL。免疫保护实验表明,在接种重组病毒21d时,鸡群抗体阳性率达到90%,使用强毒株M41(103 EID50/只)攻毒时免疫保护率为85%。本研究采用反向遗传操作技术构建的重组IBV,为进一步研制IBV重组基因工程疫苗奠定了基础。