纤维二糖磷酸化酶表达条件的优化及其酶学性质研究

纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase,CBP)磷酸化裂解纤维二糖为葡萄糖-1-磷酸,它是木质纤维素转化淀粉的关键酶。该研究将来源于Clostridium thermocellum YM4的cbp基因通过表达载体pET-28a(+)构建重组菌Rosetta(DE3)/pET-28a-CBP用于表达CBP。对其诱导表达条件进行优化,结果显示当诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)浓度和诱导时间分别为15℃、0.2 mmol/L和12 h时CBP酶活力最高,为0.47 IU/mL。进一步利用Ni柱分离纯化出带有His标签的CBP,结果表明该重组酶分子质量为95 kDa,比酶活1.03 IU/mg;最适反应温度60℃,最适反应pH 6,半失活时间为60 min;金属离子Cu^(2+)显示出对该酶有强烈的抑制作用,然后依次是Zn^(2+)、Fe^(3+)、Ca^(2+)、Mn^(4+)(P<0.05);而K^(+)、Mg^(2+)和Na^(+)对该酶活力无显著性影响(P>0.05);最后对重组CBP的动力学参数进行了表征,K_(m)值为19.61μmol/mL,V_(max)值为1.19μmol/(mL·min)且K_(cat)值为21.38 s^(-1)。

乳糖诱导纤维二糖差向异构酶的表达及热处理纯化

以Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶(Cs CE)高效表达菌株E.coli BL21(DE3)为表达载体,研究乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Cs CE表达的效果。结果表明,在菌体培养至OD600=0.6时加入终浓度为10 g/L的乳糖,25℃下诱导20 h,最终发酵液中Cs CE酶活达801 U/L,较最优条件下IPTG诱导的酶活力提高1.4倍,粗酶液的比酶活提高37%。然后,根据Cs CE的热稳定性,采用热处理工艺对粗酶液进行纯化。经70℃、2 h热处理,绝大部分的杂蛋白变性沉淀,粗酶液中可溶性蛋白浓度降低85.9%,比酶活由0.89 U/mg提高到5.46 U/mg,纯化倍数达到6.14倍,酶活回收率为86.6%。乳糖诱导Cs CE的高效表达结合热处理的初步纯化工艺,为Cs CE的工业化生产提供有益的借鉴。

纤维二糖2-差向异构酶的酶学性质及在乳制品中的应用

近年来,对纤维二糖2-差向异构酶(CE)的研究取得了许多突破性的进展。针对不同的寡糖,CE表现出不同程度的差向异构化和异构化活性,催化乳糖生成的依匹乳糖和乳果糖,两种都是有益生元性质的乳糖衍生物,在保健食品及药品中具有非常广阔的前景。因此,CE在工业应用的中游和下游工艺越来越引起重视,来自嗜温和嗜热微生物的CE也被应用于不同需求的生产中。尤其是嗜温微生物来源的CE能在较低温中保持活性,推进了CE在乳制品行业中的应用。作者针对性总结了CE的酶学性质和催化产物的最新研究进展,及其在乳制品行业中的发展。

纤维二糖差向异构酶的研究与应用概述

纤维二糖差向异构酶(cellobiose 2-epimerase)是近年来颇受关注的一种工业酶,主要应用于乳果糖(lactulose)的生物法制备,也适用于D-甘露糖的生产。全球年需求量近10万t,具有较高的商业价值,其中乳果糖可用于治疗便秘和肝性脑病,是一种常见的非处方药,效果显著。该文针对纤维二糖差向异构酶制备乳果糖工艺的酶源挖掘、蛋白质工程改造、固定化酶研究等方面进行了综述,为制备乳果糖的理论和应用研究提供参考。

纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

首先将来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶基因CsCEm进行密码子优化,然后进行全基因合成,再将其引入到载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-Cs CEm并转化入毕赤酵母GS115,得到酵母工程菌株。经微孔板筛选、摇瓶筛选得到酶活最高的重组工程菌GS115-4-19。该菌株经甲醇诱导144 h后,摇瓶发酵液上清酶活达到0.42 U/m L。酶学性质研究结果表明：该酶的最适pH为7.5,且在pH 6.0~8.0范围内相对酶活都在80%以上;在pH 4~9的缓冲液中放置24 h后仍保持原酶活力的80%以上;最适温度为80℃,在60℃~80℃保温30 min后,相对酶活在80%以上。动力学研究结果表明该酶对底物乳糖的Km和Vmax分别为（120.27±9.96）mmol/L和（1.035±0.05）mmol/L/min。纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的成功表达为生物酶法合成乳果糖提供了重要参考。

来源于 Dictyoglomus sp.NZ13-RE01的纤维二糖差向异构酶酶学性质和乳果糖制备研究

为高效制备纤维二糖差向异构酶,用于乳果糖生产,将来源于网团菌属Dictyoglomus sp.NZ13-RE01的纤维二糖差向异构酶基因引入到载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-NZ13-CE并转化表达宿主E.coli BL21(DE3),得到生产菌株BL21(DE3)-V1。该菌株在摇瓶中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导24 h后得到最高酶活力为0.53 U/mL的发酵液,在7.5 L发酵罐中高密度发酵,表达酶活力提升了8.1倍,达到4.30 U/mL发酵液。通过镍离子亲和层析柱纯化重组酶,研究NZ13-CE的酶学性质:该酶的最适反应温度为80℃,最适pH为8.0,分子质量为45.5 kDa,80℃下重组酶的活性半衰期为182 min,催化乳糖至乳果糖的最高转化率为52.5%,且依匹乳糖占总糖含量仅为9%。研究结果表明,NZ13-CE酶具有工业化生产乳果糖的应用潜力。

酿酒酵母GPD1中整合表达纤维二糖酶基因用于纤维素酒精发酵的研究

采用基因敲除技术,在工业酿酒酵母染色体DNA上的甘油代谢途径关键酶基因GD P 1中,整合入来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bgⅡl,通过提高G 418浓度筛选得到多拷贝整合子。结果表明,整合子利用纤维二糖的能力得到提高,产甘油能力下降,外源基因表达稳定;引入外源基因后,其对酵母增殖能力没有大的影响,仅形态发生变化;在以微晶纤维素为原料,结合纤维素酶发酵时,与亲代工业酿酒酵母相比,发酵液乙醇浓度最高增加69%。

嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究

研究液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)产生的一种外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacryl S-100分子筛层析、Q Sepharose Fast Flow强阴离子层析等步骤后获得凝胶电泳均一的外切葡聚糖纤维二糖水解酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得该酶的分子量大小约为66.3kDa和67.1kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为65℃和5.0。在60℃以下酶比较稳定,在70℃酶的半衰期为1h,在80℃下保温20min仍具有20%的活性,该酶的热稳定性较中温真菌的同类酶高,与国外报道的嗜热真菌的同类酶热稳定性接近。以pNPC为底物的Km值为0.956mmol/L。

裂褶菌产纤维二糖脱氢酶条件优化及部分酶学性质研究

研究了裂褶菌Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅＡＳ ５．３９１产纤维二糖脱氢酶的条件。该酶是诱导酶，棉花是最好的诱导底物。培养基中加入琥珀酸钠缓冲液和土温８０利于酶的合成。而木素相关物质黎芦醇或愈创木酚对酶的生成没有影响。该酶在ｐＨ３．５～１０．５和４５℃以下保持稳定，其最适作用温度为３０℃，最适ｐＨ为４５。Ｚｎ(２＋)和Ａｇ＋对该酶活性有很大的抑制作用，而叠氮化钠和氰化钾对酶活力没有影响。

固定化纤维二糖酶的研究

黑曲霉 (AspergillusnigerLORRE 0 12 )的孢子中富含纤维二糖酶 ,将这些孢子用海藻酸钙凝胶包埋后 ,可以方便有效地固定纤维二糖酶。固定化后的纤维二糖酶性能稳定 ,半衰期为 38d ,耐热性和适宜的pH范围均比固定化前有所增加 ,其Km 和Vmax值分别为 6 .0 1mmol L和 7.0 6mmol (min·L)。利用固定化纤维二糖酶重复分批酶解10g L的纤维二糖 ,连续 10批的酶解得率均可保持在 97%以上 ;采用连续酶解工艺 ,当稀释率为 0 .4h- 1 ,酶解得率可达 98.5 %。玉米芯经稀酸预处理后 ,其纤维残渣用里氏木霉 (Trichodermareesei)纤维素酶降解 ,酶解得率为6 9.5 % ;通过固定化纤维二糖酶的进一步作用 ,上述水解液中因纤维二糖积累所造成的反馈抑制作用得以消除 ,酶解得率提高到 84.2 % ,还原糖中葡萄糖的比例由 5 3 .6 %升至 89.5 % ,该研究结果在纤维原料酶水解工艺中具有良好的应用前景。

纤维二糖脱氢酶在纤维素降解中的作用研究

裂褶菌纤维二糖脱氢酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＣＤＨ）可以提高纤维素酶对纤维素的降解。以纤维二糖为电子供体， ＣＤＨ作用于羧甲基纤维素可降低其溶液的粘度，作用于纤维素 ＣＦ１１和磷酸膨胀纤维素，分别使其悬浊液的浊度提高７％和１４．４％。ＣＤＨ与纤维二糖水解酶或内切纤维素酶在降解棉花纤维素时没有表现出协同作用。但若棉花事先在纤维二糖存在下用ＣＤＨ预处理，则变得易于被水解。

纤维二糖脱氢酶生成羟自由基和还原各种自由基的研究

利用电子顺磁共振（ＥＳＲ）技术和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）反应研究了纤维二糖脱氢酶（ＣＤＨ）生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．以纤维二糖为电子供体时，ＣＤＨ可以生成·ＯＨ．·ＯＨ生成量与ＣＤＨ、Ｆｅ３＋和Ｏ２的浓度有关．加入过氧化氢酶可使·ＯＨ的生成明显减少．ＣＤＨ可以还原自旋加合物［ＰＢＮ－ＯＨ］·、氮氧自由基和天然木素分子中的自由基．结果表明，ＣＤＨ具有生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．

外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化和部分性质研究

Two cellobiohydrolases from Trichoderma pseudokiningii S-38 were isolatde and pruified by DEAE-Sephadex A-25 ion exchange and gel filtration chromatography. The molecular weights of the purified enzymes were estimated to be 66 000 for cellobiohydrolase Ⅰ and 67 000 for cellobiohydrolase Ⅱ respectively, by 10% SDS-PAGE. Some propertied of the purified enzymes were also determined.

具有高外切葡聚糖纤维二糖水解酶I活力的新型黄单胞工程菌的构建

由广宿主质粒ｐＲＫ４０４和微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ｉ（ＣＢＨＩ）ｃＤＮＡ基因ｃｂｈＩ构建了重组质粒ｐＲＫ４０４－１８１，在携带有诱动质粒的菌株ＥＤ８６５４（ｐＲＫ２０１３）的存在下，采用三亲滤膜结合的方法，将该质粒转移到野油菜黄单胞菌Ｓ－１５２中，并成功地得到表达。结合子Ｓ－１５２（ｐＲＫ４０４－１８１）外切葡聚糖纤维二糖水解酶的ｐＮＰＣ活力比原始菌株Ｓ－１５２提高了２～４倍，滤纸酶活提高了１倍。

纤维二糖脱氢酶的研究进展

纤维二糖脱氢酶(CDH)是由白腐菌、软腐菌及褐腐菌等真菌产生的一种木材降解菌。本文综述了CDH对糖的专一性及与纤维素的相互作用、CDH的酶反应机制和动力学及国内外的CDH的最新应用领域。

鼠李糖脂二糖脂强化酶解木质纤维素

将经过纯化的鼠李糖脂二糖脂添加于纤维素酶酶水解试验中,以稻草、竹叶为底物,分析水解过程中纤维素酶酶活(以FPA计)及还原糖浓度的变化特征,探讨和分析鼠李糖脂二糖脂对稻草和竹叶中木质纤维素水解产还原糖能力、纤维素酶活的稳定性、发酵液表面张力和pH值的影响作用。结果表明,添加鼠李糖脂二糖脂对木质纤维素类底物酶水解过程中还原糖浓度的增加、酶活稳定性的提高有明显的促进作用,并且其促进作用随着表面活性剂添加量的适量增加而增强,当添加量为0.24%时,稻草和竹叶还原糖的产量分别提高了17.19%和27.68%。此外,水解反应结束后,加入鼠李糖脂二糖脂的水解液表面张力值显著降低,且随着添加量的增高而降低,当添加量为0.24%时,可分别降至63.4和60.8mN·m-1左右,而pH值的变化微小。

牛瘤胃产纤维二糖磷酸化酶细菌的筛选及产酶条件研究

为了获得产新型纤维二糖磷酸化酶(CBP)的菌株,利用选择性培养基从牛瘤胃液中逐步分离纯化,筛选能以纤维二糖为唯一碳源生长的菌株,分别检测所筛选菌株的β-葡萄糖苷酶(βG)和CBP活力,并对其纤维二糖的利用方式(水解途径或磷解途径)进行鉴定,获得产CBP的菌株,命名为BY-a。采用形态学观察、生理生化试验,结合16S r DNA序列分析,鉴定菌株BY-a为克雷伯氏菌属(Klebsiella)。对菌种产CBP的温度、时间、最适装液量和溶氧量进行初步优化,结果显示,BY-a菌株在装液量为30mL(250mL)、37℃振荡培养24 h时,产CBP活力最高。

血红密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L10产纤维二糖脱氢酶的发酵优化

研究了血红密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L10产纤维二糖脱氢酶的发酵优化。该酶是诱导酶,微晶纤维素是其最好的诱导底物。通过对发酵培养基中培养成分的优化,添加大分子碳源微晶纤维素和小分子碳源葡萄糖作为复合碳源,发酵优化后提高到78±5.94 U/L,是未优化前的2倍(39±4.78 U/L)。通过对氮源的优化,即有机氮源黄豆粉和无机氮源磷酸氢二铵的添加,使酶活达到700±35.78 U/L,比优化前提高了近17倍。而通过四因素四水平的碳氮源正交实验之后酶活达到1245±35.78 U/L,比优化前提高了近32倍。由此,确定了当微晶纤维素为7 g/L,葡萄糖5 g/L,黄豆粉6 g/L,磷酸氢二铵2 g/L时,其他不变,此时的产酶最高,达到1 245±35.78U/L。

β-葡聚糖酶水解小麦秸秆制备纤维寡糖的条件优化

【目的】探索商品化β-葡聚糖酶水解小麦秸秆制备纤维寡糖的最佳条件,为纤维寡糖的工业化生产提供科学依据。【方法】采用浓硫酸和浓盐酸混酸降解微晶纤维素制备纤维寡糖混合物,通过分离纯化得到聚合度为2—5的纤维寡糖单一组分。用所得纤维二糖作为标准品测定小麦秸秆酶解产物中的纤维二糖,并以纤维二糖含量和小麦秸秆转化率为衡量指标,研究酶解反应温度、pH、反应酶底比E/S、反应底物浓度、反应时间对寡糖生成的影响。【结果】采用活性炭柱层析法得到了高纯度的聚合度2-5的纤维寡糖单一组分;当酶解反应温度为50℃、pH为5.5、E/S为0.4、底物浓度为2%、时间10 h时酶解效果最好,小麦秸秆总转化率达到55.57%,纤维二糖得率为148.15 mg.g-1秸秆。【结论】活性炭柱层析可以很好地分离纤维寡糖,得到了聚合度为2—5的纤维寡糖单一组分;酶解小麦秸秆总转化率及纤维二糖得率均提高。

利用纤维二糖的酵母工程菌构建

以扣囊复膜孢酵母染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增到其β-葡萄糖苷酶基因bgl1,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切并和经相同酶切的穿梭表达载体pYX212连接,构建了重组质粒pYX-sbgl,转化酿酒酵母W 303-1A,bgl1基因获得了活性表达,β-葡萄糖苷酶活力为0.504 IU/mL.转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长,并能应用于同时糖化和发酵纤维素底物生产乙醇,使乙醇产量较宿主酵母有了一定的提高.