纤维素堆囊菌源果糖激酶的克隆表达及其酶学性质研究

为促进果糖-6-磷酸的绿色生物制备,该研究对纤维素堆囊菌(Sorangium cellulosum)中的果糖激酶基因进行克隆、表达,探究重组酶酶学性质和底物特异性。以纤维素堆囊菌基因组DNA为模板,设计引物克隆果糖激酶基因SoCeFruK 1852和SoCeFruK 7579,构建重组表达质粒pET30a-SoCeFruK 1852和pET30a-SoCeFruK 7579,并在Escherichia coli(DE3)中诱导表达,纯化重组果糖激酶,研究反应产物和酶学性质。重组果糖激酶SoCeFruK1852和SoCeFruK7579的分子质量大小分别为31.2、32.8 kDa,蛋白质质量浓度为2.04、1.8 mg/mL,比活力分别为35.8、18.3 U/mg。SoCeFruK1852的最适温度和pH分别为37℃和4.5。金属离子Co^(2+)、Fe^(3+)、Zn^(2+)和化学试剂SDS、EDTA、Tween 20对酶活力有抑制作用,而Mg^(2+)和Mn^(2+)对酶活力有促进作用。以果糖为底物时,SoCeFruK1852的K_(m)值为0.54 mmol/L,V_(max)值为1.28μmol/s。SoCeFruK1852能够特异性催化果糖,但也能催化部分D-塔格糖。获得细菌来源的重组果糖激酶SoCeFruK1852和SoCeFruK7579,且SoCeFruK1852显示良好的酶活力和酶学性质,底物特异性较强,为后续相关研究奠定基础。

纤维堆囊菌发酵产生埃博霉素条件的优化

埃博霉素是纤维堆囊菌产生的一种具有抗肿瘤活性的次级代谢产物.文中研究了纤维堆囊菌DSM11999发酵合成埃博霉素的条件.结果表明:采用对数生长期后期的菌种在25℃进行发酵,将马铃薯淀粉和胰蛋白胨分别作为碳源和氮源,添加少量的无机盐MnC l4,EDTA-Fe-Na,K2HPO4,ZnC l2,CuSO4和生长促进因子丙氨酸,可使埃博霉素的产量提高22.5%.

纤维堆囊菌的多细胞形态发生过程

粘细菌是具有复杂多细胞行为的革蓝氏阴性细菌 ,纤维堆囊菌是粘细菌中唯一能够降解纤维素的粘细菌种属。本文通过扫描电子显微镜和相差光学显微镜 ,分析了纤维堆囊菌在纤维素基质上的生长和子实体形态发生的多细胞行为特征 。

纤维堆囊菌的代谢产物及其生物学活性分析

纤维堆囊菌不同菌株不但表现细胞和子实体形态的差异 ,而且代谢产物的组成和生物学活性也存在差异。纤维堆囊菌对革兰氏阴性细菌不表现任何抑制活性 ,部分菌株可抑制革兰氏阳性细菌 ;但所有菌株对真菌和肿瘤细胞有广泛和强烈的抑制作用。薄层层析显示 ,纤维堆囊菌的次级代谢产物组分较多 ,且大多数组分具有不同程度的抑制真菌和肿瘤细胞的活性。在筛选中发现四株菌的代谢产物能够促进微管蛋白聚合 ,其中So3 3 1活性组分的薄层层析Rf 值与已知的EpothiloneA相似 ,而So81的则有较大的差异。研究结果表明纤维堆囊菌是很好的筛选抗真核生物活性的天然化合物资源。

纤维堆囊菌生长及限制因素的研究

纤维堆囊菌对可溶性淀粉、木聚糖、纤维素等复杂碳源的利用能力较强 ,简单碳源中只利用葡萄糖 ;KNO3、蛋白胨是较好的氮源 ,大多数氮源都能支持生长 ,表明该菌营养要求简单 ,能高效的利用自然界里丰富的纤维素资源。堆囊菌的盐耐受能力较低 ,盐浓度高于 1%的培养基中菌体几乎不能生长 ,Mg2 +是生长必需的元素 ,Ca2 +对生长没有明显的作用 ,但是子实体的形态发生所必需的。培养基的起始pH为 7 0时细胞生长较好 ,大于 8 0或小于 5 0不生长。纤维堆囊菌生长具有细胞密度依赖性 ,低密度的细胞不能生长。固定在滤纸上的细胞淋洗液 (纤维素酶降解产物 )对细胞生长具有明显促进作用 ,并能降低细胞生长的密度依赖性。

纤维堆囊菌活性次级代谢产物的研究进展

粘细菌中的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）在近20年的新型天然化合物的筛选中以其产生的化合物种类新、结构多样、作用机理特殊等而崭露头角,已经报道的200多种化合物及衍生物在抗细菌、抗肿瘤、抗病原真核生物中有很强的作用,是很好的天然药物筛选资源,具有极大的应用价值。本文将对10种作用机理具有典型意义的次级代谢产物的生物活性做一概述。

硫酸二乙酯对纤维堆囊菌的诱变育种

本文以纤维堆囊菌(Sorangiurn cellulosum)ATCC15384的紫外突变株为出发菌株,用硫酸二乙酯(DES)进行化学诱变,最终得到了埃博霉素A和B的产量分别为13.93和6.82mg/L的高产菌株,分别比原始菌株提高了6.61和3.04倍。说明使用DES诱变可以显著提高埃博霉素产量。

纤维堆囊菌产埃博霉素B发酵培养基的优化

目的优化埃博霉素B发酵培养基。方法以纤维堆囊菌SoF5-9为供试菌株,通过单因素和正交试验研究了埃博霉素B合成的最佳培养基。结果埃博霉素B最适发酵培养基为糊精0.3%,蔗糖0.07%,葡萄糖0.02%,豆饼粉0.17%,MgSO4.7H2O 0.1%,无水氯化钙0.1%,EDTA-Fe3+2mL/L,微量元素(TE)0.5mL/L。在该最优条件下,埃博霉素B产量可达到27.5mg/L。结论合理优化发酵培养基组分可以有效提高埃博霉素B的产量。

广东6株纤维堆囊菌的分离与鉴定

采用滤纸片富集法对采自广东省信宜的土壤样品进行了粘细菌的分离和纯化，共获得6个菌株（Soce M1～So ce M6）。利用体视显微镜、倒置显微镜和扫描电镜对这些菌株的子实体、菌落及营养细胞等进行了形态学的观察和特征描述。同时，还测定了6个菌株的16SrRNA基因序列，应用blast程序与GenBank中已知的纤维堆囊菌及其他粘细菌序列进行比对，并采用邻位相连法（Neighbor-Joining，NJ）构建了分离菌株与相关菌株的系统发育树。结果表明：6个菌株均为纤维堆囊菌（Sorangium cellulose），但这些菌株在形态特征和16S。RNA基因进化距离上存在着一定的差异，表现出纤维堆囊菌菌株的形态多样性和遗传多样性。

用于吸附固定纤维堆囊菌的硅藻土基多孔陶瓷制备

以硅藻土为主要原料,采用添加造孔剂法制备硅藻土基多孔陶瓷,研究造孔剂大小、造孔剂用量、成型压力对多孔陶瓷性能的影响,通过正交优化实验确定最佳工艺方案。结果表明,在30目木屑造孔剂质量分数为2.5%,7 MPa下制得的硅藻土基多孔陶瓷性能良好,孔径集中在5μm,比表面积为23.55 m2/g,孔隙率为32%,机械强度为10.2 MPa,用其固定纤维堆囊菌进行发酵,埃博霉素B产量提高了42.6%,达到31.8 mg/L。

纤维堆囊菌Soce90菌株发酵合成新型抗癌物质epothilones的营养控制

Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ是从粘细菌纤维堆囊菌（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｕｌｏｓｕｍ）中新分离的一类具有抗肿瘤活性的次级代谢产物。本文研究了影响纤维堆囊菌Ｓｏｃｅ９０菌株合成ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ的条件。结果表明：菌体的生长状态对产物的合成有影响，指数期接种物、低氮高碳培养条件、某些盐离子、氨基酸和乙酸盐对ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ的合成有益。

响应面法优化纤维堆囊菌SoF5-76产埃博霉素B发酵培养基

以纤维堆囊菌SOF5-76为试验菌株,用响应面分析法对其产埃博霉素B的培养基进行优化,以提高埃博霉素B的产量。在单因素试验的基础上,利用Plackett-Burman筛选出对埃博霉素B产量有显著影响的3个因素为马铃薯淀粉、脱脂奶粉和无水氯化钙,在此基础上通过最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域;再运用Box-Behnken试验设计和响应面分析法进行回归分析,确定重要因素的最优浓度。得到最佳发酵培养基为:马铃薯淀粉3.9 g/L、脱脂奶粉2.2 g/L、无水氯化钙1.3 g/L、葡萄糖1 g/L,豆饼粉1.5g/L,七水硫酸镁2.5 g/L,EDTA-Fe3+3 mL/L,微量元素(TE)0.5 mL/L,VB121 mL/L。在此最优条件下发酵埃博霉素B的产量为29.95 mg/L,与模型预测值接近,发酵产量比优化前提高了1.1倍。

纤维堆囊菌产物生物学活性的研究

通过分析纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)子实体的性质,子实体提取物的体外抑菌活性,体外肿瘤细胞抑制活性和动物体内毒性及抑瘤活性,探索纤维堆囊菌子实体作为药用菌材料的可行性和药用前景。实验证明,纤维堆囊菌子实体代谢物组成稳定,子实体的提取物对于真菌有显著而广泛的抑制活性,并且对革兰氏阳性细菌也有一定的抑制作用,对于肿瘤细胞如肝癌Bel7402株系具有很强的体外杀伤活性,子实体提取物灌胃对小鼠无毒性反应,并能够明显抑制移植瘤S180的生长。实验结果说明纤维堆囊菌子实体具有作为药用资源的潜力。

纤维堆囊菌发酵所用消泡剂的筛选

本文分析了5种消泡剂的消泡抑泡效果和对纤维堆囊菌的影响,对生物量,埃博霉素产量等方面进行考察,选择了具有良好消泡抑泡性能,对纤维堆囊菌生长有显著促进作用的SXP107有机硅聚醚复合消泡剂。在此基础上对使用浓度进行优化,并研究其对发酵过程的pH和还原糖的影响。结果是:体积浓度为0.08%,菌体干重达171.2 mg的消泡剂效果最好。

利用异源表达挖掘纤维堆囊菌So0157-2的新型天然产物

黏细菌是天然产物的重要来源。纤维堆囊菌So0157-2是抗癌药物埃博霉素的产生菌,并且是已知基因组最大的原核生物。生物信息学分析发现该菌一共含有35个次级代谢产物生物合成基因簇,除了已知的埃博霉素基因簇和其他两个萜类化合物生物合成基因簇与已知基因簇的相似度为100%之外,其他基因簇与已知化合物基因簇相似度均较低,其中包括17个聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)、非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)及其杂合的基因簇。由于纤维堆囊菌So0157-2生长缓慢、培养困难且难以在本源菌中进行遗传改造。因此,将其生物合成基因簇转移到简单宿主中,利用异源表达策略是挖掘该菌中新颖天然产物的一个有效途径。本文利用直接克隆技术从纤维堆囊菌So0157-2基因组DNA中克隆了1个包含NRPS和PKS结构域的基因簇BGC18,将其转移至伯克氏菌DSM 7029中进行异源表达。通过液质联用分析,色谱柱靶向分离纯化,进而通过NMR结构鉴定和Marfey反应确定了3个化合物分别为Cyclo(N-Me-L-Leu-L-Val)(1)、Cyclo(N-Me-L-Leu-LLeu)(2)、Cyclo(N-Me-L-Leu-L-Ile)(3)。化合物结构的多样性来源于第1个腺苷化结构域对底物识别的宽泛性(Val/Leu/Ile)。生物合成途径分析推测由于缺少硫醇化结构域导致PKS模块被跳过,从而只获得了NRPS指导合成的环二肽产物1~3,这可能是细菌中一种实现化合物多样性的方式。本论文以基因簇直接克隆与异源表达相结合的策略,成功实现了一个来源于纤维堆囊菌So0157-2中的NRPS-PKS杂合基因簇的异源表达,分离并鉴定了3个该基因簇对应的表达产物。本研究为后续从该菌株中挖掘更多活性天然产物奠定了技术基础,也为其他难培养菌株的次级代谢产物的挖掘提供了思路。

纤维堆囊菌子实体提取物的急性毒性和遗传毒性分析

[目的]研究纤维堆囊菌(So ce9882)子实体提取物的急性毒性和遗传毒性,为粘细菌新资源的开发利用提供依据。[方法]采用急性经口毒性试验、Ames试验、小鼠精子畸形试验。[结果]急性经口毒性试验表明纤维堆囊菌子实体提取物属实际无毒物质。Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果均为阴性。[结论]在本次实验条件下,纤维堆囊菌子实体提取物为实际无毒物质,未显示有遗传毒性作用。

纤维堆囊菌生理生化及药敏特征

对纤维堆囊菌模式菌DSM14627的生理生化和药敏性进行了系统的考察,研究显示该菌能利用葡萄糖及纤维素,不能分解利用麦芽糖、蔗糖等12种碳源;磷酸酶、β-葡萄糖苷酶及明胶液化实验为阳性,过氧化氢酶、β-木糖苷酶等13项实验均阴性;对丙氟哌酸、万古霉素、多粘霉素B等15种抗生素敏感,对氨苄西林及苯唑青霉素等10种抗生素有极强抗性。

纤维堆囊菌的初步分离纯化鉴定及快速培养

研究纤维堆囊菌的分离纯化及快速培养方法。通过不同培养基多次划线及单孢子囊挑取,筛选出纤维堆囊菌纯化菌株;用VY/2培养基、CNST、LB培养基对筛选出的菌株进行初步鉴定,确定3个菌株为纤维堆囊菌;在培养基中添加牛肉膏,可极显著促进纤维堆囊菌的生长。

产生埃博霉素的纤维堆囊菌的分子筛选

为寻找潜在的产生埃博霉素(epothilone)的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum),以埃博霉素生物合成基因簇中的epoA,epoC和epoK基因为探针,分别对60株不同土壤样品来源的纤维堆囊菌的DNA样品进行PCR筛选.筛选结果得到了7株阳性菌株,进一步对其进行发酵和粗提物的HPLC-MS分析,检测结果显示3株菌XMU-Nc-03,XMU-So-64和XMU-So-112能产生埃博霉素B,其中XMU-So-112的产量最高.本实验在筛选产埃博霉素活性菌株的同时,还建立了一个快速可靠的发现埃博霉素产生菌的方法.

诱导纤维堆囊菌高产埃博霉素的种间微生物筛选及鉴定

微生物之间存在相互作用,引入异己微生物通常可以诱导某微生物的代谢调控。筛选到一株能促进纤维堆囊菌高产埃博霉素的微生物,鉴定为烟曲霉Aspergillus fumigatusM03。该菌株的有机粗提物可以诱导纤维堆囊菌埃博霉素A和B的产量分别提高72.3%和59.7%,其适量菌体水相粗提物也有相同的诱导作用,使埃博霉素A和B的产量分别提高25.6%和24.7%。该菌株的菌体水相粗提物高温失活后对埃博霉素合成的诱导作用消失,添加浓度增加时出现抑制作用。该菌株发酵液对埃博霉素的合成没有促进作用,且随着浓度的增加抑制作用增强。