毛白杨纤维素合成酶基因(PtoCesA1)克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1），序列分析表明该基因序列为3215bp，与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97％具有开放的阅读框，编码区在52～2985碱基之间，编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点，将全长基因克隆到植物表达栽体pBll21中，经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确，为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。

圆果黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1的克隆及利用反义载体转化拟南芥

以圆果黄麻(Corchorus capsularis L.)"179"茎部韧皮为材料,利用同源克隆和RACE技术,克隆黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1 5′端500 bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529 bp,编码627氨基酸残基,经Blast基因比对和蛋白质结构分析,确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明,CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性,依次为茎部韧皮>根>叶>顶芽>麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3′UTR区,构建黄麻CcCesA1基因反义载体,用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern杂交结果表明,外源基因以单拷贝方式整合进入基因组,转基因拟南芥生长严重受阻,植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏,角果数量变少,长度变短,纤维素含量有不同程度的降低,本研究结果表明,所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外,还参与纤维素的生物合成。

绿竹与毛竹纤维素合成酶(CesA)的生物信息学分析

纤维素是竹细胞壁的主要组成成份,其存在形式———小微纤丝是由纤维素合成酶(CesA)催化作用得到的36根β-1,4糖苷链结晶而成。以GeneBank数据库中已登陆的完整竹类蛋白序列为分析对象,对其进行系统进化、物理性质、跨膜结构和二级结构的生物信息学分析。结果表明:(1)绿竹和毛竹CesA与水稻CesA具有较高同源性;(2)绿竹和毛竹CesA等电点为6.16-8.62;(3)绿竹和毛竹CesA具有5个,6个或者8个跨膜结构;(4)绿竹和毛竹CesA主要存在α螺旋、β转角(最少)、延伸链和无规卷曲(最多),不含如310螺旋、Pi螺旋、β桥、弯曲区域等结构。

烟草纤维素合成酶1(CESA1)蛋白结构比较

纤维素合成酶1(cellulose synthase 1,CESA1)可催化合成纤维素,参与植物细胞壁的生物合成过程.烟草品种WS38的CESA1基因尚未被克隆,烟草属间的CESA1结构特征差异未知.本研究通过RT-PCR方法克隆了烟草WS38 CESA1基因的cDNA;依据其推导的编码氨基酸序列,利用生物信息学方法比较了3个烟草间的CESA1蛋白结构特征.结果表明,烟草WS38 CESA1基因cDNA全长3276 bp,编码1091个氨基酸,与烟草SR1以及花烟草(Nicotiana alata)CESA1序列同源性超过98%.3个烟草的CESA1一级结构、二级结构以及三级结构比较相似,但也存在一定的差异.其中烟草WS38和SR1之间的差异性较WS38与花烟草(Nicotiana alata)之间的小;3个烟草CESA1典型结构特征均相同,N端都具有1个锌指结构,均具有8个跨膜结构域,磷酸化位点修饰均相同,均具有蛋白激酶活性.此外,3个烟草的CESA1均定位在细胞质膜上,它们的蛋白亲缘关系相近,功能应较为一致.

黄瓜纤维素合成酶CESA家族基因鉴定及非生物胁迫响应分析

纤维素合成酶(cellulose synthase,CESA)是纤维素合成过程中重要的酶类,在细胞壁建成和植物生长发育过程中起着非常重要的作用。本试验从黄瓜品系9930全基因组数据中鉴定得到35个CESA基因家族成员,系统进化分析将家族成员分成6个group。亚细胞结果显示,大部分成员定位于质膜上,少部分定位在高尔基体上。物种间CESA家族基因共线性分析显示,拟南芥和番茄的CESA基因家族与黄瓜CESA基因家族分别有15个和12个同源基因对,西瓜和甜瓜CESA基因家族与黄瓜CESA基因家族分别有19个和20个同源基因对。顺式作用元件分析表明,CsCESA家族基因具有植物激素、非生物胁迫、时空表达和生物进程相关的顺式作用元件。转录组数据和qRT-PCR结果显示,CsCESA家族基因在不同组织中差异表达,并且大部分基因受非生物胁迫和植物激素的诱导表达,其中CsCESA5、CsCESA20和CsCESA28均能响应低温、盐胁迫、ABA和MeJA的诱导,推测这3个基因可能在黄瓜响应非生物胁迫中发挥重要作用。

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473。以苎麻(Boehmeria nivea)栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5'及3'RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4。BnCesA4 cDNA序列全长4 008 bp,其中编码区全长3 270 bp,编码一个含1 090 aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列。根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种:湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析。qRTPCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大。

马尾松纤维素合成酶基因PmCesA2的克隆及其植物表达载体的构建

为了探究马尾松木材形成的分子机制,以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松CesA2基因的全长cDNA序列(命名为Pm Ces A2),序列长度为3 500 bp,包含一个长为3 174 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码1 057个氨基酸。序列分析表明:PmCesA2序列与已报道的火炬松Ces A2基因(AY789651.1)的相似性达98%。将全长基因克隆到载体p BI121质粒的Sna BI,Sac I双酶切位点之间,构建正义表达载体p BI121-PmCesA2。

植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成

纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源,1996年克隆了第一个植物纤维素合成酶基因,植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶如Korrigan纤维素酶,蔗糖合成酶等来共同完成。本文介绍了植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成途径及其相关基因如蔗糖合成酶基因、KORRIG-AN基因等研究进展。

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻[Boehmeria nivea(Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号为材料,通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA15′端450bp序列以外的全部cDNA序列,序列长3276bp,编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示:BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达,其表达量为茎>叶>芽>根,相对表达量依次为0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。

植物纤维素合成酶基因的进化分析

从基因库中调取已完成测序的纤维素合成酶CesA(Cellulose synthase)基因序列和氨基酸序列,共涉及15个物种的89个基因,基于以上氨基酸序列,应用常用的系统发生关系树生成软件MEGA3.1,做出这89个基因的系统发生关系树。综合已知的模式植物CesA基因的功能(仅指初生壁或次生壁形成特异性),可推测某些未知功能基因的可能功能。研究还发现绿竹CesA基因与玉米和大麦CesA基因在系统发生关系和同源性方面关系密切。CesA一级结构可变区中半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸等氨基酸的含量变化较大,在同一位点半胱氨酸多是与丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸发生相互替换。

棉花与拟南芥纤维素合成酶基因家族的生物信息学比较

为给克隆到的棉花纤维素合成酶CesA基因的功能分析提供参考,采用生物信息学、基因保守结构域搜索、聚类分析和电子拼接技术,分析了拟南芥和棉花纤维素合成酶在基因组上的分布,预测了从棉花中克隆到的纤维素合成酶CesA基因的功能。结果表明:棉花中克隆的纤维素合成酶基因与拟南芥纤维素合成酶基因参与纤维素、多糖生物合成的纤维素合成酶基因亲缘关系较近,推测克隆的基因可能参与纤维素合成或参与多糖的生物合成过程,该基因的具体功能有待进一步深入研究。

雷竹纤维素合成酶基因cDNA克隆与表达分析

根据绿竹纤维素合成酶(cellulose synthase)基因的保守区序列设计引物,以雷竹cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为3 385 bp,共编码1 056个氨基酸,将其命名为PpCesA1基因。氨基酸序列的分析结果表明,PpCesA1与其他纤维PeCesA4素合成酶有较高的同源性,同绿竹序列相似性高达94%,且其序列具有典型的Cellulose_synt-GT-A结构域,推测此PpCesA1为雷竹纤维素合成酶基因。对雷竹不同组织采用半定量方法研究该基因的表达情况,结果表明该基因在不同组织中的表达有明显差异。

植物纤维素合成酶基因的研究进展

纤维素是植物细胞壁的主要成分。自然界中每年大约有 180 0亿吨的纤维素产物生成。纤维素的巨大经济价值使纤维素合成酶基因成为基因工程的热点之一。 1996年 ,Delmer小组首次从植物中克隆出纤维素合成酶基因。近年来 ,在纤维素合成酶的结构、功能、定位和基因功能的研究方面成果斐然。

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区。利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列。应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因。多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71%以上。利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础。

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.

纤维素合成酶及其在基因工程中的应用

纤维素是地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源,广泛存在于植物和部分细菌中。近年来,关于植物纤维素分子生物学的研究一直是国际相关研究的热点。从几种典型植物的纤维素合成酶基因入手,综述了植物纤维素合成酶的特性、纤维素合成酶基因的克隆与序列特征及其蛋白结构特征。

毛竹生长过程中纤维素合成酶基因的时空表达和功能预测

毛竹Phyllostachys edulis是中国主要的经济竹种,纤维素合成对于竹材的形成具有重要意义。纤维素主要由纤维素合成酶(CesA)合成,并储存在植物的初生壁和次生壁中。通过生物信息学方法、透射电镜观察以及荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术研究了毛竹纤维素合成酶的表达和功能。共获得16个毛竹纤维素合成酶家族基因。结构域分析表明:毛竹纤维素合成酶都含有cellulose_synt结构域,N端大多有锌(Zn)指结构。毛竹韧皮部细胞超微结构观察发现:次生壁随着高的增加而加厚,次生壁的初始形成在上升期(1.2m)。定量分析表明:8个基因(PeCesA1,PeCesA2,PeCesA3,PeCesA4,PeCesA5,PeCesA6,PeCesA9和PeCesA13)在次生壁形成的部位表达最显著,3个基因(PeCesA6,PeCesA9和PeCesA13)在初生壁结构部位表达最显著。结合前人对相同时期毛竹的纤维素含量研究,推测在毛竹幼竹生长过程中PeCesA1,PeCesA2,PeCesA3,PeCesA4和PeCesA5基因主要参与毛竹次生壁的合成,PeCesA6,PeCesA9和PeCesA13对初生壁和次生壁的形成都起到一定作用。

大麦纤维素合成酶截短体的重组表达及多克隆抗体制备

对大麦纤维素合成酶(Hordeum vulgare CesA,Hv-CesA)的蛋白质序列进行疏水性分析和跨膜区预测,获得截短的亲水性非跨膜区特征序列,采用PCR扩增截短序列编码区,定向克隆入N端带有His标签的pET-28a(+)表达载体中,并转化大肠杆菌进行诱导表达,利用钴离子螯合层析纯化重组表达蛋白,并制备高效价的多克隆抗体。结果表明,截短的Hv-CesA基因在大肠杆菌Rosetta gami2以包涵体的形式高效表达,western blotting显示制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原。

利用全测序基因组数据对被子植物纤维素合成酶基因的进化分析

利用已经分离的植物纤维素合成酶基因的Cellulose_synt结构域为检索序列,从NCBI和其他数据库中调取已完成测序的物种的纤维素合成酶的氨基酸序列,共涉及10个物种的171个基因,基于以上氨基酸序列,应用MEGA4.0生成系统进化树。结果表明:CesA基因和Csl基因直向的相似度远大于平行的相似度,且它们的分化可能在单子叶和真双子叶植物分化之前,单子叶和真双子叶植物的最近共同祖先中至少存在7个CesA基因,综合已知的模式植物CesA基因的功能(初生壁或次生壁形成特异性),可为推测其他物种中该基因的功能提供帮助。

生长素结合蛋白与纤维素合成酶在同一细胞中的标记与定位

生长素通过其结合蛋白(ABP1)促进细胞纤维素合成并使细胞伸长生长。为探明ABP1与纤维素合成酶(CesA1)这2种蛋白质之间的相互关系,分别对这2种蛋白质进行了荧光标记,构建了绿色荧光蛋白(GFP)对ABP1融合标记以及青色荧光蛋白(CFP)对CesA1融合标记的2种载体。采用烟草叶片侵注法,将2种重组体转入烟草叶片同一细胞进行瞬时表达。扫描激光共聚焦显微成像观察到转基因瞬时表达的烟草铺列细胞的细胞膜上有强烈两色荧光信号,表明这2种蛋白集中在细胞膜上分布,其分布区域存在明显的重叠。在细胞的内膜系统中绿色荧光信号相对较强,青色荧光信号较弱,表明内膜系统中也分布着一定量的ABP1,而纤维素合成酶在内膜系统中不会集中分布。在叶片铺列细胞间嵌合交错区可以观察到青色荧光的高亮点,表明此处存在纤维素合成酶的高密度分布,也说明在此部位有更多的纤维素合成。