基因工程改造促进大肠杆菌发酵纤维素水解液合成1,2,4-丁三醇

1,2,4-丁三醇(BT)是广泛应用于各领域的高附加值化合物之一,利用纤维素水解液发酵生产BT需要一株能够耐受其中抑制物的菌株。在水解液中常见抑制因子糠醛存在下,大肠杆菌的发酵严重受限。本研究首先在含有BT合成途径的大肠杆菌中过表达四种糠醛耐受相关的基因:yghA、thyA、mdtJI和pntAB。在0.4g/L糠醛压力下,所有改造菌株的生长均有不同程度的提升,其中过表达pntAB基因的菌株生长最好,同时有助于BT合成酶的酶活力或转录水平的提高,BT产量达到11.0g/L。当以玉米芯纤维素水解液为底物时,过表达yghA、thyA和pntAB均明显促进了大肠杆菌的生长与BT产量的提高,其中yghA基因表现最好,在摇瓶中获得了3.36g/L的BT,在5L发酵罐中BT产量达到15.3g/L,转化率为63.8%。该策略为玉米芯纤维素水解液发酵生产BT提供了借鉴。

大肠杆菌对木质纤维素水解液抑制物的胁迫耐受性

木质纤维素类生物质是前景广阔的化石原料替代品,其生物炼制可生产生物能源、生物基化学品和生物材料等多种产品,可降低碳排放,有助于实现“双碳”目标,因此受到越来越多的关注。然而,木质纤维素生物炼制需要经过预处理、微生物发酵和产物纯化等多个步骤,其中,预处理过程产生的多种化合物抑制微生物的细胞生长和发酵性能,是制约生物转化效率的瓶颈之一。大肠杆菌是木质纤维素生物炼制常用的宿主,被广泛应用于多种化合物的生产,研究其对木质纤维素水解液中抑制物的耐受性,对于提高木质纤维素生物炼制效率具有重要意义。本文首先介绍了木质纤维素的主要成分和基本结构,对木质纤维素的预处理方法以及预处理后水解液中的主要抑制物种类进行了简单阐述;随后,总结了木质纤维素水解液中几类主要抑制物呋喃类、羧酸类和酚类对大肠杆菌细胞的毒性,以及大肠杆菌对上述抑制物的胁迫响应机制和基于机制的菌株改造靶点;最后,综述了提高大肠杆菌对上述抑制物的胁迫耐受性的菌株改造策略,包括随机突变、实验室适应性进化和组学辅助的理性设计等,为利用代谢工程构建用于木质纤维素生物炼制的高效大肠杆菌菌株提供参考。

富羟基核/壳结构碳基催化促进剂的制备及辅助催化纤维素水解成糖

以葡萄糖为碳源、四种不同的碳材料为基材,通过水热合成制备出富羟基的核/壳结构碳基催化促进剂。所得催化促进剂壳层表面富含大量羟基,其氧含量高达16%~18%。通过使用富羟基核/壳结构碳基催化促进剂,能明显提升了纤维素水解成糖的效率。结果表明,利用含以碳纳米管为基材的纳米级催化促进剂体系,纤维素转化率及葡萄糖产率最佳,达到约96%及77.7%。

利用蔗渣半纤维素水解液产油酵母的筛选、鉴定及发酵实验

对已分离到的产油酵母通过木糖摇瓶发酵,从中筛选到2株H2-1和J2-2利用蔗渣半纤维素水解液高产油脂酵母,其利用蔗渣半纤维素水解液油脂得率系数分别为13.49和10.28,均显示出对蔗渣半纤维素水解液的高转化率。根据常规生理生化特征和26SrDNA序列分析结果,确认H2-1为小红酵母(Rhodotorula minuta),J2-2为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。

半纤维素水解液中抑制物对发酵生产木糖醇的影响

以木糖为底物发酵生产木糖醇,考察了葡萄糖、阿拉伯糖、果糖等半纤维素糖类对木糖醇发酵动力学行为的影响,并确定了适宜起始木糖质量浓度为100 g/L.当发酵液中乙酸与糠醛的质量浓度分别超过1 g/L时,抑制作用逐渐增强,通过调节半纤维素水解液的起始pH值从4.0到6.0,可有效减轻乙酸对发酵的抑制作用.适量的K+、Mgz+、Na+等微量元素和H2PO4-离子对酵母具有较强的代谢调控作用,其中以Mg2+的影响最为显著.无机盐质量浓度在0～4 g/L内有利于木糖醇发酵.以合成培养基为底物发酵生产木糖醇,与半纤维素水解液的发酵结果相比,两者的动力学曲线较为符合,为进一步研究木糖醇发酵动力学提供了实验依据.

假丝酵母发酵玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇

采用一株驯化过的假丝酵母 (Candidasp .)直接发酵经过简单脱毒处理的玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇。确定了水解液的最适浓缩倍数在 3 0～ 3 72的范围内。利用正交实验 ,确定了摇瓶分批发酵工艺条件的最适组合为 :摇床转速 180r min ,起始C N为 50 ,起始pH 5 5,接种量 5% (体积比 )。在此基础上 ,重点研究了在发酵罐中通气量对酵母发酵玉米芯水解液生产木糖醇的影响。结果表明采用先高后低的分段通气发酵在木糖醇得率方面明显优于恒定通气发酵 ;其中 ,在 0～ 2 4h ,3 75L min ;2 4～ 10 8h ,1 2 5L min的分段通气条件下 (装液量为 2 5L) ,木糖醇得率 (木糖醇 木糖 ,g g)达到 0 75g g。该结果将有助于建立一种高效的。

纤维素水解研究进展

近年来纤维素的有效降解和转化问题已成为制约木质纤维素生物质有效利用的主要瓶颈之一。纤维素降解和转化方法的研究已成为当今科技界的一大研究热点,它对解决当前的资源、能源和环境问题都具有重要意义。将纤维素水解为葡萄糖等糖类物质是纤维素利用的重要途径。本文详细综述了目前有关纤维素水解的各种方法和相关研究进展。

固定化细胞发酵半纤维素水解液产木糖醇的研究

固定在海藻酸钙凝胶中的热带假丝酵母(Candidatropicalis)细胞,可有效地利用玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇。在摇瓶条件下,采用分批发酵方式,确立了适宜的发酵工艺参数为:32℃,每升氮源含酵母粉2.2g、胰蛋白胨3.7g,发酵液初始pH值6.0,分段改变摇床转速,其中0～24h为210r/min;24～72h为140r/min,固定化细胞凝胶珠与玉米芯半纤维素水解液体积比为1∶4。利用固定化细胞重复进行10批次共30d发酵,木糖醇得率平均为73.7%,达到了理论值的80%。固定化细胞密度高、抗逆性强、发酵性能稳定,水解液未经脱色与离子交换便可转化成木糖醇,显示了良好的应用前景。

利用纤维素水解液中的纤维二糖发酵制备丁二酸

纤维素水解液中通常含有纤维二糖。本文考察了Actinobacillus succinogenes NJ113利用纤维二糖厌氧发酵生产丁二酸的能力,并利用蔗渣纤维素制备纤维二糖作为碳源用于厌氧发酵生产丁二酸。3 L发酵罐厌氧发酵结果显示:以35 g/L纤维二糖作为碳源发酵制备丁二酸,其产量为23.51 g/L,产率达到67.17%;用含有18 g/L纤维二糖和17 g/L其它糖类的蔗渣纤维素水解液作为碳源发酵制备丁二酸,丁二酸的产量和产率分别为20.00 g/L和64.73%。因此,Actinobacillus succinogenes NJ113具有较强的利用纤维二糖生产丁二酸的能力,而且利用废弃的纤维素制备纤维二糖作为碳源高效、经济地发酵制备丁二酸具有可行性。

半纤维素水解液发酵木糖醇的关键因子

为了提高Candida sp.ZU-04发酵玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇的得率,采用石灰中和、石灰过中和、活性炭脱色、离子交换树脂吸附等措施对水解液进行脱毒处理,并在3.7 L发酵罐中(30℃、转速300 r/min、pH5.5)考察了不同通气条件对发酵工艺的影响.结果表明,弱碱性离子交换树脂D301对半纤维素水解液具有良好的脱毒效果,能明显改善半纤维素水解液的发酵性能;分阶段改变通气速率比恒定通气速率发酵生产木糖醇得率更高,前期(0-24 h)通气速率为3.75 L/min,后期(24-96 h)通气速率为0.75 L/min,木糖醇得率为76.0%,体积生产速率为0.76 g/(L.h),该工艺为工业上利用半纤维素水解液大规模发酵生产木糖醇奠定了基础.

酵母发酵蔗渣半纤维素水解物生产木糖醇

采用二次正交旋转组合设计研究了蔗渣半纤维素水解过程中硫酸浓度与液 固比对木糖收率的影响。回归分析表明 ,这两个因素与木糖的收率之间存在显著的回归关系。通过回归方程优化水解条件 ,当硫酸浓度 2 .4g L ,液 固 =6 .2 ,在蒸汽压力 2 .5× 10 4Pa的条件下水解 2 .5h ,10 0g蔗渣可水解生成木糖约 2 4g。大孔树脂吸附层析处理蔗渣半纤维素水解物 ,能有效地减少其中的酵母生长抑制物含量 ,显著改善水解物的发酵性能。用大孔树脂在pH 2条件下处理过的蔗渣半纤维素水解物作基质 ,含木糖 2 0 0g L ,产木糖醇酵母菌株CandidatropicalisAS2 .1776发酵 110h耗完基质中的木糖 ,生成木糖醇 12 7g L ,产物转化率 0 .6 4(木糖醇g 木糖g) ,产物生成速率 1.15g L·h .

从蔗渣半纤维素水解物发酵液中分离纯化木糖醇

蔗渣半纤维素水解物发酵液必须经过超滤处理,后续的离子交换柱层析过程才能顺利进行。超滤透过液经离子交换柱层析脱盐之后,再经活性炭脱色,这种木糖醇液浓缩至可溶性固形物含量为80%,即可结晶得到含量≥98.5%的木糖醇产品。结晶母液经连续浓缩之后得到的第二次结晶和第三次结晶,则必须经重结晶后才能获得含量≥98.5%的木糖醇产品。从发酵液中的木糖醇到含量≥98.5%结晶木糖醇,产品总收率约为70.6%。本工艺适宜超滤膜的截留分子量为5000kD,阴、阳离子树脂的适宜比例约1.5:1(V/V),活性碳用量为木糖醇溶液可溶性固形物含量的2.5%。当结晶母液中的阿拉伯糖浓度超过木糖醇浓度的45.0%,木糖浓度超过木糖醇浓度的12.6%时,它们都容易与木糖醇一起结晶析出。存在于这种母液中的木糖醇将难于通过结晶的方法而继续得到有效的纯化。

白蚁及共生微生物木质纤维素水解酶的种类

白蚁是热带生态系统重要的木质纤维素降解者。白蚁种类丰富,可分成高等白蚁和低等白蚁,食性也具有各自特点。白蚁自身可以产生纤维素酶,主要是GHF9的内切葡聚糖酶(EG),也有β-葡萄糖苷酶(GB)。低等白蚁共生的原虫中已发现丰富的纤维素酶基因,属于GHF5,7和45。同时还有其他相关功能基因,如木聚糖酶和果胶类物质水解酶。高等白蚁肠道中没有共生原虫。高等培菌白蚁可以利用共生蚁巢伞属真菌促进木质纤维素降解,真菌可以产生纤维素酶,果胶质水解酶类、木聚糖酶,同时还产生可能与木质素分解相关的一种漆酶,但是从分子水平,关于共生真菌纤维素水解酶的研究还较少。白蚁肠道已分离出许多具有木质纤维素降解能力的菌株,最近的研究也发现了大量细菌纤维素酶基因。白蚁-共生系统丰富的木质纤维素水解酶类为发展生物方法开发纤维素乙醇这一思路提供有价值的资源。

纤维素水解酶的复配应用研究

以玉米秸秆酶解率为评价指标,采用混合试验设计优选商品纤维素水解酶的复配条件。结果表明最佳酶复配条件为滤纸酶活(FPU)∶CMC酶活(IU)∶β-葡萄糖苷酶(IU)∶木聚糖酶(IU)=8∶1∶133∶33。

纤维素水解液中木糖发酵制丁醇

对实验室菌种进行筛选后，得到一株能利用纤维素水解液木糖发酵生产丁醇的菌株。研究发现，该菌株不仅能利用水解液中的葡萄糖，还可以利用水解液中的木糖。对菌种生长特性探索，批式发酵中碳源、氮源以及CaCO3等条件优化后，得到最佳种子培养时间为20～24 h，并确定了木糖浓度为20 g/L的纤维素水解液用于15 L发酵罐实验，在37 ℃静置培养84 h，丁醇产量10.95 g/L，总溶剂16.78 g/L（丙酮、乙醇、丁醇三者之和），木糖利用率达到70%以上，总溶剂转化率为39.4%。解决了纤维素水解液中木糖不能被利用而造成的经济损失问题。

高效液相色谱法检测蔗渣半纤维素水解物中的单糖

用高效液相色谱法测定甘蔗渣半纤维素水解物中的单糖含量。以 Hypersil NH2 柱为色谱分析柱 ,用示差折光检测器检测 ,流动相是乙腈∶水 (80∶ 2 0 )。在此色谱条件下 ,甘蔗渣半纤维素水解物分离成 :木糖、阿拉伯糖、果糖和葡萄糖。各单糖呈良好的线性关系。加样回收率的平均值为 97.3%～ 98.7% ,此方法简便、快速、准确。

固定化乳酸杆菌发酵纤维素水解液的研究

采用海藻酸钙凝胶包埋法固定德氏乳酸杆菌,固定化细胞可有效地利用纤维素水解液发酵生产乳酸。与游离细胞相比,固定化细胞具有发酵时间短、乳酸得率高等优点,其最适发酵温度为48℃,添加适量的麸皮水解液对乳酸发酵有明显的促进作用,乳酸得率可达90.1%。利用固定化细胞重复分批发酵纤维素水解液生产乳酸,连续16批发酵试验表明,固定化细胞性状稳定,产酸能力强,乳酸平均得率为88.6%。利用固定化细胞在柱式反应器中连续发酵纤维素水解液,当稀释率为0.12h-1时,乳酸得率和生产效率分别达到80.2%和4.97g/(L·h)。

甘油和半纤维素水解液共发酵生产1,3-丙二醇

建立了以K.pneumoniae为菌种,甘油和半纤维素水解液(HH)共发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PDO)的体系。通过添加HH,1,3-PDO的质量浓度、甘油的转化率和生产力比甘油单独发酵分别提高了18.2%,24.4%,18.0%。HH中的木糖和甘露糖能显著提高1,3-PDO的产量和生物量,葡萄糖对1,3-PDO的合成产生抑制,半乳糖和阿拉伯糖对1,3-PDO的合成没有影响。与不添加抑制物相比,添加0.28 g/L糠醛时,生物量提高了12%,1,3-PDO的产量有微量提高;添加0.61 g/L甲酸盐时,对细胞生长和1,3-PDO的合成产生轻微抑制,分别降低了9.8%和1.1%;添加1.46 g/L乙酸盐时,细胞生长略有提高,1,3-PDO的质量浓度从8.77 g/L增至11.73 g/L。在补料分批发酵中添加HH,1,3-PDO的质量浓度、甘油的转化率和生产力分别提高到71.58 g/L,65%,1.93 g/(L.h),比甘油单独发酵分别提高了17.8%,25.0%,17.7%。

菌肥用光合菌在纤维素水解液中的培养

对光合菌在天然培养基、合成培养基以及来自植物纤维素水解液的半合成培养基中的培养进行了研究 ,对适宜的培养基、营养物质的稀释度、菌种接种量、pH值等进行了选择 .对选出的 4号加有纤维素水解液的培养基 ,接入 5 %的菌液 ,pH为 7.0～ 7.5 ,温度为 2 5～ 30℃ ,厌氧条件下 ,光合菌生长良好 ,菌量达 2 .2× 10 9亿个/mL ,在加入光合菌生长促进液 (1% )后 ,菌量达 4.0 1× 10 9个 /mL .

半纤维素水解液中抑制物对少根根霉发酵产富马酸的影响

考察了半纤维素水解液中含有的主要副产物乙酸、甲酸以及糠醛等对少根根霉利用木糖、葡萄糖发酵产富马酸的影响。少根根霉种子培养阶段对甲酸和糠醛的浓度较敏感,而乙酸对产酸发酵具有显著抑制作用;种子培养基中乙酸、甲酸和糠醛的浓度应分别控制在1.5、0.5、0.5 g/L以内。采用木糖为种子培养碳源,添加上述浓度的各种抑制物模拟半纤维素水解液用于少根根霉菌体的种子培养,后继利用葡萄糖发酵产富马酸35.4 g/L。