纤维糊精酶DM1与CBD的融合及融合酶性质分析

纤维糊精酶(cellodextrinase)属纤维素酶类中的一类,可以从短链纤维素分子上水解糖苷键生成葡萄糖或纤维二糖。曾克隆了纤维糊精酶DM1的编码基因,该酶与生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的Cellodextrinase A的一致性为52%。通过人工合成基因的方法合成了细菌来源的3个分别为家族_4_9(GenBank索引号为AAA73869)、家族Ⅲc(GenBank索引号为BABB33148)和家族10(GenBank索引号为CAA60493)的纤维素结合功能域(CBD)和连接桥(linker)的DNA序列。通过把编码纤维糊精酶DM1(GenBank索引号为ACA61162)的催化功能域(CD)的DNA序列与合成的CBD和连接桥的DNA序列进行融合,构建了3个融合酶,并分别在大肠杆菌BL21中得到过量表达。纤维素结合实验表明,3个纯化的融合酶对结晶纤维素(Avicel)和滤纸粉末均有结合能力,融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc与结晶纤维素(Avicel)结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为58.60%、51.16%和21.13%,与滤纸粉末结合的蛋白质占总蛋白的比例分别为65.59%、60.47%和22.54%,证实与原始酶相比3个融合酶的CBD均有纤维素结合的功能。酶学特性研究表明,融合酶的最适pH、最适温度、pH稳定性和温度稳定性等没有显著改变,均未检测到3个融合酶有新的活性,但它们对p-nitrophenylβ-D-cellobioside(pNPC)、p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)和lichenan等底物的比活力显著降低。3个融合酶CBD_4_9-DM1、DM1-CBD10和DM1-CBDⅢc对pNPC的比活力分别为原始酶DM1的26%、2%和2%,对lichenan的比活力分别为原始酶DM1的12%、8%和2%,几乎检测不到后两个融合酶对pNPG的酶活。