纤维素结合域的研究进展

纤维资源是生物界最为丰富的有机碳源,有效酶解植物纤维资源对于减缓能源枯竭和食品危机具有重要意义。然而,天然纤维素结构上的复杂多样性为酶的攻击和可及带来巨大困难。为了克服这一问题,自然界中能够利用纤维原料的酶大多由相对独立的两种结构域、催化结构域(CD)、纤维素结合结构域(CBM)组成。其中,CBM有助于酶与不溶性底物的结合,在纤维原料酶解中具有重要作用。CBM所具备的特殊的底物特异性不仅对于提高酶与纤维的可及度,增强纤维素酶解效率,揭示纤维素酶解机制具有重要意义,而且应用在基因工程产品的分离纯化,酶制剂的品质改善及细胞固定化等领域也有很好的发展前景。本文就近年来CBM的研究现状及其发展前景进行了综述。

纤维素结合域的酿酒酵母表面展示及其黏附位点初探

利用酿酒酵母表面展示系统表达产琥珀酸丝状杆菌S85纤维素结合域家族2(CBD2),分析其纤维黏附位点。将CBD2基因插入质粒pYD1的AGA2 3′端,构建pMCBD2重组质粒,化学转化pMCBD2至酿酒酵母EBY100中,2%半乳糖诱导CBD2表达于酿酒酵母表面。利用免疫组化技术检测重组酵母细胞在稻草茎细胞壁上的黏附位点。结果表明:利用酿酒酵母表面展示系统可成功表达产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2基因;重组CBD2的pMCBD2-EBY100与稻草茎孵育后,经抗V5异硫氰酸荧光素标记抗体处理可在稻草茎的薄壁、厚壁和维管组织均检测到荧光。产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2黏附稻草多个组织。结果提示:酿酒酵母表面展示技术与免疫组化技术联用研究瘤胃细菌CBD的黏附位点是可行的。

微生物纤维素结合域的研究及在生物技术中的应用

概述了微生物纤维素结合域的来源、分类及作用机理,总结了近年来微生物纤维素结合域在亲和层析、细胞固定化、诊断学、蛋白质工程、靶向定位及体内细胞壁修饰等领域的应用状况。

纤维素结合域的引入对角质酶在纤维素类纤维上吸附性能的影响

为了研究纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)的引入对角质酶在纤维素类纤维上吸附能力的影响,选用漂白棉织物、粘胶纤维、醋酯纤维以及纯棉针织坯布这4种材质,对角质酶与CBD-角质酶进行吸附对比试验。研究表明:CBD结构的引入可提高角质酶在纤维素纤维上的吸附量,但是当纤维素葡萄糖残基上羟基被部分酯化后,CBD结构的引入对吸附量造成的影响开始减弱,而当纤维素纤维表面被疏水性杂质覆盖时,CBD-角质酶对纤维素纤维的吸附能力反而降低。

一种包含双纤维素结合域的新型生物纸张增强剂

将两个来源于草菇乙酰木聚糖酯酶的家族I的纤维素结合域(CBD)融合到一起形成重组蛋白,并将该功能性纤维素吸附重组蛋白在大肠杆菌中进行表达,利用该重组蛋白处理What-man滤纸后检测滤纸的机械性能。检测发现经纯化的重组蛋白处理后的滤纸其机械性能都有所提高,其中抗张强度提高了10%,耐破度提高了8.7%,耐折度提高了30%。该研究表明CBD在纤维及造纸工业等方面具有巨大的潜在应用价值。

屎肠球菌纤维素结合域谷氨酸脱羧酶构建及其酶学性质

为了开发可用于高效固定化的优质谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15),以Enterococcus faecium GDMCC60203为gadB基因供体,对纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)GAD融合酶(CBD-GAD)的构建及其酶学性质进行了探讨。结果显示:构建的含pRPOCB-EfagadB重组质粒的Escherichia coli GDMCC 60445可高效表达CBD-GAD,120 mL发酵液制备的纤维素固定化CBD-GAD的活力为(347.93±27.63)U/g;在无氨苄青霉素LB培养基中连续培养5批,E.coli GDMCC 60445仍可稳定表达CBD-GAD;经一步纯化,CBD-GAD在SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子质量约为74.02 kDa;CBD-GAD最适反应pH和温度分别为4.6和60℃,在pH 4.8~5.6和4~40℃较稳定,仅对L-谷氨酸具有催化活性,K m和V max分别为10.58 mmol/L和3.83μmol/(mL·min),其催化反应不受底物和产物抑制。重组菌株稳定,CBD-GAD酶学性质优良,有望应用于γ-氨基丁酸和D-谷氨酸工业化生产。

大肠杆菌高效表达屎肠球菌纤维素结合域谷氨酸脱羧酶的条件优化

为了规避大肠杆菌( Escherichia coli )自身基因组表达的天然GAD的干扰,以再生无定形纤维素(regenerated amorphous cellulose,RAC)特异性吸附纤维素结合结构域谷氨酸脱羧酶(cellulose-binding domain-glutamate decarboxylase,CBD-GAD)制备的RAC-CBD-GAD固定化酶作为评价指标,采用单因素和田口试验设计法对 E. coli GDMCC60445高效表达CBD-GAD的条件进行了优化。结果表明, E. coli GDMCC60445表达CBD-GAD的适宜培养基为改良LB (Luria-Bertani)培养基,其组成为胰蛋白胨8 g/L、酵母膏 6 g/L、NaCl 10 g/L 、pH 5.5;适宜的培养条件为温度37 ℃、摇床转速120 r/min、培养时间24 h。在该适宜条件下,RAC-CBD-GAD活力为(419.79±10.37) U/g,与田口法预测值一致,较优化前提高了(30.28±3.22)%。

应用纤维素结合域标签构建谷氨酸棒状杆菌表达系统

为优化谷氨酸棒状杆菌表达系统的纯化工艺,合成里氏木霉的CBD基因,将其与谷氨酸棒状杆菌分泌表达载体pXMJ19-sp连接,构建以CBD为纯化标签的重组载体pXMJ19-sp-CBD。在该载体中插入GFP基因并转化至谷氨酸棒状杆菌,可获得分泌表达融合蛋白GFP-CBD的重组菌。该菌经IPTG诱导后的发酵液在紫外灯下显示强烈的绿色荧光,重组蛋白的分泌表达量达200 mg/L。利用CBD标签对纤维素柱的可逆性吸附,可直接对谷氨酸棒状杆菌分泌到培养基中的重组蛋白进行纯化,从而简化工艺和降低成本,为工业化大生产奠定基础。

内切纤维素酶在纤维素底物上的初始吸附动力学

应用双波长紫外分光光度法实时监测了两种内切纤维素酶(EGV和EGI)在α-纤维素上的初始吸附,并结合动力学方程探讨了可能的吸附机理。实验结果表明,带纤维素结合域(CBD)的内切纤维素酶在底物上的吸附非常迅速,仅需4min左右即可达到准稳态,其吸附动力学曲线与准二阶动力学模型的预测值几乎完全一致。通过改变纤维素酶EGV的初始浓度得到的平衡吸附数据符合Langmuir等温吸附模型,表明该酶的初始吸附可能是单分子层化学吸附。内切纤维素酶EGI的吸附动力学较为复杂,约每7min即发生明显的脱附,然后重新吸附。内切纤维素酶的特异性吸附是由CBD决定的,缺少CBD的内切纤维素酶以缔合的形式沉积在纤维表面,其吸附动力学更多依赖于其胶体化学性质。

海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B与木聚糖酶XynA CBD结构域融合基因的构建、表达及融合酶性质分析

海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B是极耐热胞外酶，氨基酸序列分析表明不含有纤维素结合结构域（CBD），对结晶纤维素无活性，但同样菌种来源的木聚糖酶XynA有催化结构域和纤维素结合结构城。用同样极耐热酶CBD区域和Cel12B融合构建重组质粒pET-20b—Cel12B—CBD，经诱导表达后，对结晶纤维素有活性，酶学特性研究表明：最适反应温度为100℃、最适pH为5．8、在pH4．5—7．0时酶活力稳定，90℃保温2h仍有87％的酶活。

L-谷氨酸氧化酶与CBD的融合表达及其在微晶纤维素上固定化分析

酶的固定化作为一种重要的技术,已在生物催化领域得到了广泛的应用。现将来源于普拉特链霉菌3304(Streptomyces platensis NTU3304)产生的胞外L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,Gox)基因gox融合到来源于粪碱纤维单胞菌Cellulomonas fimi的纤维素结合域(CBDcex)的基因上,构建表达载体p ETM10-Gox-CBD,并在大肠杆菌中表达。通过蛋白纯化获得融合蛋白,并命名为Gox-CBD。利用CBD对微晶纤维素特异性吸附的特性将其固定在微晶纤维素上,并对固定化酶的制备条件、结合量、酶学性质及其微晶纤维素结合稳定性等进行了研究。在4℃条件下结合约1 h,融合蛋白Gox-CBD结合在纤维素上的结合量即可达到9.0 mg/g。通过对重组型、融合表达游离的以及固定化在微晶纤维素上的谷氨酸氧化酶的酶学性质进行比较发现,固定化酶的比酶活有所降低;但固定化酶的热稳定性相对于游离酶有了很大的提高,在60℃孵育30 min后还保留有约70%的活性,而游离的重组Gox在相同条件下几乎完全失去活性。当固定化结合蛋白在p H<10或者盐浓度>5 mmol/L的Na Cl条件下可以牢固结合。并且可以通过一步纯化方法固定化融合蛋白Gox-CBD于微晶纤维素上。因此,L-谷氨酸氧化酶与纤维素结合域融合表达的研究为蛋白的纯化及酶的固定化提供了一种新策略。

碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。

屎肠球菌源谷氨酸脱羧酶的制备及其酶学性质研究

为了开发谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD),以Enterococcus faecium为gadB基因供体、纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)为亲和标签,利用内含肽DnaB自剪切作用分离GAD,对融合酶CBD-DnaB-GAD的构建、表达、GAD纯化及其酶学性质进行了探讨。结果表明:重组Escherichia coli GDMCC60446可高效表达CBD-DnaB-GAD,适宜自剪切液为0.2 mol/L Na_(2)HPO_(4)-NaH 2PO_(4)缓冲液(pH 6.5,含NaCl 0.5 mol/L、EDTA 1 mmol/L);经一步纯化和自剪切制备的GAD在SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子质量约为55.68 kDa,仅有1个亚基;GAD最适反应pH和温度分别为5.0和55℃,在pH 4.8~5.8和-25~55℃较稳定;5 mmol/L的NaCl、CaCl_(2)和乙二醇对GAD酶活力影响不大,而KCl、EDTA-2Na、ZnSO_(4)、CuSO_(4)、MnSO_(4)、MgSO_(4)、FeCl_(2)、FeCl_(3)、AlCl_(3)、AgNO 3和Pb(CH_(3)COO)_(2)对GAD酶活力具有不同程度的抑制作用;GAD仅催化L-谷氨酸发生脱羧反应,K m和V max分别为10.51 mmol/L和3.41μmol/(mL·min),催化反应无底物和产物抑制作用。GAD纯度和酶学性质优良,制备工艺简便,该技术有望应用于工业化生产。