一种检测凝血酶、类凝血酶的新方法——纤维蛋白原平板法

目的:创建一种定量检测凝血酶(Thrombin)、类凝血酶(Thrombin-likeenzymes)活性的新方法——纤维蛋白原平板法。方法:采用纤维蛋白原作为底物,用琼脂糖与纤维蛋白原制作成纤维蛋白原平板,以凝血酶、类凝血酶标准品分别在该平板上的扩散反应,制作相应的标准曲线及回归曲线,并对凝血酶、类凝血酶活性作定量测定。结果:本法制作的凝血酶、类凝血酶检测标准曲线具有良好的线性关系(r=0.9994、r=0.9997)。结论:纤维蛋白原平板法可用于凝血酶、类凝血酶定量测定。具有操作简便、直观、稳定、敏感度高,不受检品浊度或颜色干扰且成本低廉等特点。

纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改进

对利用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活力的方法进行了改进,对测定纳豆激酶活力的标准曲线的规律进行了研究。研究发现,当尿激酶活力在200U/mL～10000U/mL时,尿激酶活力的常用对数lgU与对应的溶圈面积S呈线性相关,其表达式的斜率与孵育时间、孵育温度和平板厚度有关。通过试验确定了测定纳豆激酶活力的最佳孵育时间为15h,此时的酶活测定标准曲线为:lgU=0.0052S+b,b值的确定方法为:将2种标准尿激酶液的酶活力和对应的溶圈面积分别带入标准曲线lgU=0.0052S+b中,分别求出其对应的修正系数b1、b2,以b=b1+2b2为标准曲线lgU=0.0052S+b的修正系数,利用此法计算酶活力的相对误差为0.22%。

含肝素中和剂的纤维蛋白原功能法试剂的临床应用探讨

目的:探讨含肝素中和剂(鱼精蛋白等)的纤维蛋白原功能法试剂的临床应用。方法:选取30名自愿者,分别用肝素抗凝真空采血管和枸橼酸钠真空采血管,抽取合格血样,以2500r/min离心15min制成乏血小板血浆备用。应用色彩终点法试剂1(添加肝素中和剂),手工法分别测定肝素抗凝血样及枸橼酸钠抗凝血样中的纤维蛋白原含量;应用试剂2(未添加肝素中和剂),手工法测定枸橼酸钠抗凝血样中的纤维蛋白原含量。结果:两种试剂所测得的纤维蛋白原结果极为接近,结果差异无显著性。添加肝素中和剂的试剂测定的两种抗凝剂的抗凝血样得到的两种纤维蛋白原结果,与未添加肝素中和剂的试剂测定枸橼酸钠抗凝血样得到的纤维蛋白原结果之间皆高度相关,其测得的两种纤维蛋白结果之间也高度相关。结论:应用加入肝素中和剂的纤维蛋白原测定试剂,既可以应用于枸橼酸钠抗凝血样,又可以应用于肝素抗凝血样以及各种原因所致的血浆中肝素浓度较高的血样。

一种改良的纤维平板法

介绍一种改良的用以快速地定性和半定量检测纤溶活性蛋白的纤维平板法.对该方法中的几个关键因素作了详细的研究和探讨.纤维平板中纤维蛋白原和纤溶酶原的浓度对裂解面积不产生任何影响,但是纤维蛋白原的浓度会对裂解圈的观察产生影响,纤维蛋白原浓度低于0.2 mg/mL时会使背景色过淡而不能清晰地观察到裂解圈.尿激酶浓度在2～250 mU/μL范围时,尿激酶浓度的对数和裂解圈相互垂直的两条直径乘积的对数之间存在明显的线性关系.在本实验设计方案下,尿激酶的最佳使用浓度为10～20 mU/μL.同时,本文还探讨了纤维平板中纤溶酶原的去活条件,当琼脂纤维平板凝固后很难完全去活纤溶酶原,但是,在琼脂纤维蛋白原混合物凝固前于95℃持续温浴40 min,则能彻底去活纤维蛋白原中残留的纤溶酶原.

纤维蛋白原-凝血酶时间法用于水蛭质量控制方法的研究

目的:建立一种基于用血液凝固分析仪测定纤维蛋白原-凝血酶时间的水蛭生物活性测定方法(Fibg-TT法),定义效价并建立水蛭标准品。方法:就基源为蚂蟥和日本医蛭的水蛭分别建立了反应体系,水蛭浸提液比空白对照凝固时间延长1 s作为1个效价单位(U),定义并测得水蛭标准品效价。将高、中、低浓度的水蛭标准品和供试品的浸提液与0.5%的纤维蛋白原混合,加入凝血酶,用血凝仪测定凝固时间,结果进行对数转换后,用生物检定统计法中的量反应平行线3.3法测定供试品的效价。结果:本实验测得蚂蟥和日本医蛭标准品的效价分别为5650 U·g-1和4130 U·g-1,当两者浸提液的浓度分别在121.5~1130 U·mL-1和17.3~66.1 U·mL-1范围内时,对数凝固时间与浓度线性较好(r=0.9985;0.9965),准确度(RSD=4.5%,n=6;RSD=3.6%,n=6)、重复性(RSD=3.8%,n=6;RSD=2.4%,n=6)和中间精密度(RSD=1.7%,n=6;RSD=2.4%,n=6)均良好,该方法测定结果可靠。结论:该方法用延长凝固时间来定义水蛭的效价,并建立水蛭标准品,具有可行性。Fibg-TT法,操作简便,人为因素影响小,客观准确,重复性和中间精密度好,能区分和量化不同批次水蛭的效价,可用于水蛭效价的测定,控制其质量。

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在转基因烟草中的表达

实验室构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)植物表达载体并转化入根瘤农杆菌GV3101。该农杆菌以叶盘法转化烟草,建立表达t-PA的转基因烟草体系。通过对转化植株进行Southern blotting,RT-PCR,Western blotting和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测,结果显示,在转基因烟草中成功地表达出有活性的人t-PA。

一个纤维蛋白原γ链Arg275His突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症家系

目的 对一个遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析。方法 采集家系3代5人外周血,吸取上层血浆用血凝仪检测活化部分凝血酶原时间、凝血酶原时间、凝血酶时间、蛋白C活性、蛋白S活性和抗凝血酶活性,纤维蛋白原活性和抗原分别用Clauss法和免疫比浊法进行检测。以常规酚-氯仿法抽提家系所有成员外周血基因组DNA,PCR扩增纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序以检测基因突变。结果 先证者活化部分凝血酶原时间、凝血酶原时间正常,凝血酶时间超出正常上限值2倍以上,纤维蛋白原活性明显下降,抗原也低于正常范围,且活性显著低于抗原;其母表型检测结果与之相似。基因分析显示先证者呈纤维蛋白原FGG基因第8外显子g.5 6 78G>A杂合碱基置换,导致Arg2 75 His错义突变,该突变来源于母系。结论 纤维蛋白原γ链Arg2 75 His杂合错义突变是引起该家系异常纤维蛋白原血症的原因。

纳豆激酶活性测定方法的比较

纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌经发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶,可用于溶栓药物的开发。本文比较了两种测定纳豆激酶活性方法:琼脂糖——纤维蛋白平板法和枯草杆菌蛋白酶活力测定方法,为快速、准确地标示纳豆激酶的效价提供技术支撑。

芩丹汤对慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清炎性因子及血浆纤维蛋白原的影响

目的:观察清肺活血法对慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者血清白细胞介素(IL)-6,IL-8,肿瘤坏死因子(TNF)-α,血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)和血浆纤维蛋白原(Fg)及呼出气一氧化氮(Fe NO)的影响,以探讨其对AECOPD的治疗作用。方法:将64例AECOPD患者随机分为对照组和治疗组,对照组给予AECOPD常规西药治疗,治疗组在常规西药治疗基础上加用清肺活血的芩丹汤,观察两组的临床疗效及治疗前后血清IL-6,IL-8,TNF-α,hs-CRP,血沉及血浆Fg和Fe NO水平指标的变化。结果:治疗组有效率90.63%(29/32),高于对照组71.88%(23/32)(P<0.05);治疗前两组患者血清IL-6,IL-8,TNF-α,hs-CRP,血沉及血浆Fg和Fe NO水平比较,差异无统计学意义,治疗后两组IL-6,血沉较治疗前无显著变化,差异无统计学意义,治疗后两组IL-8,TNF-α,hs-CRP及血浆Fg和Fe NO水平较前有显著改善(P<0.05),但治疗组较对照组水平降低显著(P<0.05)。结论:清肺活血的芩丹汤对AECOPD患者体内炎症反应具有一定的调节作用,降低AECOPD患者IL-8,TNF-α,hs-CRP和血浆Fg,Fe NO水平,而发挥治疗作用。

当归原药材与标准汤剂一致性评价

通过对比分析当归原药材与标准汤剂的体外活血活性标准,并建立其高效液相指纹图谱,以期对当归原药材与标准汤剂的质量相关性进行分析.采用纤维蛋白原平板法,以尿激酶、生理盐水分别作为阳性、阴性对照,透明圈大小为指标对当归原药材与标准汤剂的体外活血活性进行测定,采用高效液相色谱法建立其指纹图谱.实验结果显示:体外活血活性标准对比时,当归原药材有透明圈,而标准汤剂无透明圈;当归原药材与标准汤剂的高效液相指纹图谱均有8个共有特征峰,原药材比标准汤剂多一个峰A,但活血活性效应与8个共有特征峰并无相关性.实验结果表明,当归原药材与标准汤剂存在一定的差异性.

活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价测定法的建立

目的建立活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价测定方法,用于评价和控制其质量。方法分别对Markwardt法、纤维蛋白原平板法(沉淀法)测定水蛭和活血通脉胶囊的生物效价进行比较研究;选择琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)作为活血通脉胶囊生物效价测定方法,考察试验系,并进行了方法学验证。结果琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)测定水蛭和活血通脉胶囊抗凝血酶生物效价的中间精密度RSD分别为3.5%、5.2%,优于Markwardt法(RSD分别为15.6%、12.9%)。本法的线性范围为5 BP^20 BP(R2=0.994),回收率为98.26%,RSD 2.3%(n=6),中间精密度RSD 3.2%,重复性RSD 4.7%。结论琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)可用于活血通脉胶囊中抗凝血酶活性生物效价的测定,以评价和控制其生物质量。

冠心病患者肺炎衣原体感染的研究

目的探讨肺炎衣原体(CP)感染与冠心病(CHD)之间的关系,了解炎症和感染在CHD发病中的作用。方法采用酶联免疫法检测40例CHD患者(CHD组)和40例健康体检者(对照组)血清CP特异性抗体IgG,同时检测血清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、C反应蛋白(CRP)和血浆纤维蛋白原(Fg)的水平。结果CHD组CP特异性抗体IgG滴度及阳性率显著高于对照组(P<0.05);CHD组血清TNFα、CRP和血浆Fg水平非常显著高于对照组(P<0.01);CHD组IgG阳性患者血清TNFα、CRP和血浆Fg水平显著高于IgG阴性患者(P<0.05)。结论CP感染可能通过介导炎症反应参与CHD的发病过程。

重组纳豆激酶工程酵母菌发酵研究

利用在纤维蛋白平板法基础上进行改造的纤维蛋白原—琼脂糖平板法,筛选具有纳豆激酶活性的基因工程酵母菌。并用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶纤溶活性。通过甲醇诱导从近100个菌落中筛选出5株纳豆激酶活性较高的重组纳豆激酶工程菌。同时确定了重组纳豆激酶酵母菌的最佳甲醇诱导浓度2%,产酶高峰时间为96h。

基于酶活性的地龙质量标准再评价研究

目的：建立基于体外酶活性法的地龙质量标准。方法：采用纤维蛋白原平板法,以尿激酶为参照,测定地龙蛋白酶的活性。结果：尿激酶在60-360 U/m L范围内与溶圈面积呈良好线性关系,r=0.999;平均加样回收率为98.84%,RSD为0.87%。结论：该法可快速、简便、准确地测定地龙所含蛋白酶的活性,可用于地龙质量控制。

纳豆菌(Bacillus natto)纤溶活性分析

通过纤维平板法测定了纳豆菌（ＢａｃｉｌｕｓＮａｔｏ）的裂解纤维凝块抗血栓活性。同时，初步探索了该菌抗血栓有效成份—纳豆激酶（Ｎａｔｏｋｉｎａｓｅ）在３７℃下产率最高，该菌的液体培养５０ｈ左右酶活性最佳。并查明该酶在培养液ｐＨ为６．３０～１０．８０。

不同纳豆产品纳豆激酶纤溶活性的比较

本研究对不同品牌纳豆产品的纳豆激酶的纤溶活性进行了比较,并检测了纳豆激酶的pH稳定性和热稳定性.在实验室条件下,通过盐析法浸提、硫酸铵分级沉淀,从纳豆中提取纳豆激酶,通过建立琼脂糖—纤维蛋白板对样品进行点样试验,测其纤溶活性并比较.结果表明,美屋大粒纳豆和美屋黑粒纳豆的纳豆激酶纤溶活性较高;纳豆激酶的纤溶活性最适pH为8,当pH<5时,纳豆激酶失去活性;纳豆激酶在40℃以下时活性稳定,超过70℃,酶活力显著下降.

发酵纳豆中加入中药后对纳豆激酶活力的影响

目的:通过对纳豆发酵中加入中药苦参、板蓝根、漏芦、红花后纳豆激酶活力的改变进行研究,从而筛选出能够提高纳豆激酶活力的中药,同时也将中药之药性融入其中,以便更好地提高纳豆之医疗、保健功能。方法:本实验采用纤维蛋白-琼脂糖平板法测定发酵后产物中纳豆激酶的活力大小。结果:苦参、板蓝根可提高纳豆激酶活性,漏芦可降低纳豆激酶活性,红花可抑制枯草芽孢杆菌的生长使之没有活性。结论:发酵纳豆中加入中药后对纳豆激酶的活力有不同程度的影响。

酶解水蛭地龙混合药渣的工艺研究及其产物的抗凝活性评价

[目的]考察蛋白酶酶解水蛭地龙混合药渣的工艺条件,评价其酶解产物的抗凝活性。[方法]分别采用碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶对混合药渣进行酶解实验。采用凝血酶滴定法和纤维蛋白原平板溶圈法评价酶解产物的体外抗凝活性,以确定最佳酶种类。溶液pH、酶底比、酶解时间、酶解温度为考察因素,单因素实验优化酶解工艺。[结果]与药渣对照组和蛋白酶对照组对比发现,水蛭地龙混合药渣酶解液显示出较强抗凝活性。其中,碱性蛋白酶酶解产物的抗凝效果最好。其最佳工艺条件为酶底比0.95%、pH 11.4、酶解温度45℃,酶解时间4 h。[结论]经碱性蛋白酶酶解后,水蛭地龙药渣酶解液的抗凝活性最强。实验为废弃药渣的再利用提供实验依据和开发方向。

纳豆激酶活性测定的方法与酶活性单位

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种具有溶栓功能的丝氨酸蛋白酶,与临床溶栓药物相比,具有价格低、效率高、可口服、无毒副作用等优点,是一种理想的预防和治疗血栓疾病的天然活性物质。基于纳豆激酶的天然生物酶学性质,目前市场产品的酶活性检测方法与活力单位的使用存在不同。NK的活性测定方法大致可分为两类:一是通过生物学方法,利用NK溶解纤维蛋白的特性测定其纤溶活性,如琼脂糖-纤维蛋白平板法、血清板法、纤维蛋白块溶解时间法(CLT)、酶联反应吸附法等。二是以NK的水解活性为基础来测定其活性,比如甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)法、酪蛋白水解法、四肽底物法等^([1])。NK的活性表示单位有“U”、“IU”和“FU”一、NK活性测定方法(一)生物学方法1、琼脂糖-纤维蛋白平板法琼脂糖-纤维蛋白平板法的原理是用琼脂糖作为固体支持,以凝血酶和纤维蛋白原作用后制成人工血栓平板,取NK样品点于平板上,37℃恒温孵育18h,用溶解圈垂直直径的乘积(mm2)来表示纤溶活力。

补肾活血法改善血栓前状态不明原因复发性流产患者内膜的异常血管生成作用

目的:探讨补肾活血法对血栓前状态(PTS)不明原因复发性流产(URSA)患者PTS因子和血管生成相关因子的作用及其可能机制。方法:收取15例正常人工流产者(正常组)与12例URSA妊娠失败者(URSA组)外周血清和蜕膜组织。收集64例未孕者[31例有良好生育史妇女(对照组)和33例PTS URSA者(治疗组)]的外周血清。运用RT-PCR法检测正常组和URSA组蜕膜组织中血管生成因子(VEGF)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA的含量。采用ELISA法测定4组治疗前后外周血清中纤维蛋白原(FIB)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和VEGF、TGF-β1的水平并检验是否存在趋同性。运用中医证候积分计算补肾活血法治疗PTSURSA的有效率并随访患者远期的妊娠率和活产率。结果:与正常组比较,URSA组外周血清中FIB、t-PA的表达显著升高(P<0.01),而蜕膜组织中VEGF、TGF-β1 mRNA含量显著降低(P<0.05,P<0.01)。治疗前,治疗组较对照组外周血清中FIB、t-PA显著升高和VEGF、TGF-β1显著降低(P<0.01);经过治疗后,治疗组较治疗前FIB、t-PA因子均下降且VEGF、TGF-β1因子水平升高(P<0.05)。治疗组证候积分治疗后显著降低(P<0.01),治疗有效率为72.73%。结论:PTS URSA已孕患者外周血清中PTS因子的升高和蜕膜中血管生成相关因子水平的异常降低可能与PTS URSA患者早期流产有关;补肾活血法可以通过调节外周血清中FIB和t-PA水平和蜕膜中VEGF和TGF-β1水平参与改善PTS URSA患者母胎界面血液高凝状态,为正常妊娠提供基础。