腺病毒介导BMP-2/7共表达转染兔滑膜MSCs体外向纤维软骨样细胞分化的研究

目的通过使用腺病毒介导BMP-2/7共表达载体转染兔滑膜MSCs(synovial-derived MSCs,SMSCs),观察其在体外向纤维软骨样细胞分化的可行性。方法取3月龄新西兰大白兔6只,雌雄不限,体重(2.1±0.3)kg;取滑膜组织分离纯化SMSCs后,进行形态学观察及免疫细胞荧光染色、流式细胞仪、细胞周期鉴定,并检测其成脂、成骨、成软骨多向分化潜能。同时包装pAdTrack-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-BMP-7腺病毒载体,转染SMSCs后进行增殖动力学、核型分析、流式细胞仪检测细胞DNA含量、致瘤性分析等安全性鉴定。体外在不完全成软骨培养基中培养,观察其分化状态,并行RT-PCR检测、免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色检测。结果从兔滑膜组织中分离出的SMSCs,其细胞形态、表面标记、多向分化潜能等均符合MSCs的特点。pAdTrack-BMP-2-IRES-BMP-7转染SMSCs的转染率约为70%。安全性鉴定结果显示转染后的SMSCs倍增时间、染色体数目及DNA含量均正常,且无致瘤性。体外不完全成软骨培养基诱导培养21 d后,RT-PCR检测示SMSCs的Ⅰ、Ⅱ型胶原表达明显增加,以Ⅱ型胶原为主;软骨分化信号分子RhoA与Sox-9的表达经诱导后也明显增加。免疫荧光染色及甲苯胺蓝染色结果亦显示转染后的SMSCs向纤维软骨样细胞分化。结论使用腺病毒载体安全有效,可在体外定向诱导兔SMSCs向纤维软骨样细胞分化。

大鼠血浆血清对软骨细胞纤维化转变的影响

目的观察大鼠的血清和血浆对大鼠软骨细胞的增殖,形态改变,基质蛋白及基质调控基因的表达变化。方法取出生24h SD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得软骨细胞,取P1代细胞进行实验。软骨细胞分别培养于含10%大鼠血浆(rat plasma,RP)和10%大鼠血清(rat serum,RS)的DMEM低糖培养基中,分别为血浆组和血清组。分别培养24h,镜下观察细胞形态变化,CCK8方法检测24h、48h和72h软骨细胞增殖(A_(450))。细胞免疫荧光、Western blot和定量PCR检测软骨指标Sox9、Ⅱ型胶原、MMP13、Col2a1、A-can、ADAMTS5、MMP9、MMP3的表达。结果培养于大鼠血清和血浆的培养基中,24h后血清组的软骨细胞由鹅卵石样排列的多角形变成长梭形。血清组24h(0.67±0.01),48h(1.29±0.05)和72h(1.92±0.03)A_(450)值,明显高于血浆组24h(0.43±0.01),48h(0.72±0.01)和72h(1.27±0.04)A_(450)值,差异均有统计学意义(P<0.01)。血清组软骨细胞MMP13和Col1a1表达显著上调,Ⅱ型胶原和Sox9的表达显著下调。PCR结果表明,血清组A-can(0. 24±0. 01)和Sox9(0.56±0.04)基因表达相对于大鼠血浆组Sox9(1.00±0.05)和A-can(1.00±0.08)表达明显降低,而血清组ADAMTS5(34.51±2.25)和MMP3(40.33±2.43)表达相对于大鼠血浆组ADAMTS5(1.02±0.21)和MMP3(1.00±0.11)表达明显增强,两组间基因表达差异均有统计学意义(P<0.01)。结论血清促进软骨细胞转变成纤维样软骨细胞。