富含亮氨酸重复序列/Ⅲ型纤维连接蛋白4在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨富含亮氨酸重复序列/Ⅲ型纤维连接蛋白4(leucine-rich repeat and fibronectin typeⅢdomain-containing protein 4,LRFN4)在胃癌组织中的表达情况,并分析LRFN4表达水平与胃癌患者临床病理参数和预后的关系。方法收集2017年1月至12月于中山大学附属第一医院胃肠外科中心确诊并行手术治疗的胃癌患者组织标本8对(包含胃癌组织和癌旁正常组织),并选取2004年1月至2005年12月在同一中心行手术治疗的117例胃癌患者的术后组织标本制成胃癌组织芯片。分析LRFN4在癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库胃癌数据集中的表达情况,应用蛋白质印迹法及实时荧光定量聚合酶链反应检测LRFN4在8对新鲜胃癌组织及癌旁正常组织中的表达,应用免疫组织化学检测LRFN4在胃癌组织芯片中的表达。分析不同LRFN4表达水平的胃癌患者其临床病理参数的差异。应用Kaplan-Meier法分析不同LRFN4表达水平的胃癌患者的预后情况。应用单因素和多因素Cox回归分析法分析胃癌患者预后的影响因素。结果LRFN4在TCGA数据库胃癌数据集的胃癌组织以及新鲜胃癌组织中呈高表达状态。LRFN4高表达的患者,表现出更大的肿瘤大小以及更为进展的T分期、N分期、M分期和TNM分期(均P<0.05),其预后也较差(P<0.001)。单因素和多因素Cox回归分析提示LRFN4在胃癌组织中的高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素(HR=3.898,95%CI 2.273~6.686,P<0.001)。结论胃癌组织中LRFN4高表达与患者较差的预后相关,可能成为预测胃癌患者预后的生物标志物之一。

肌肉转录调节因子和连接蛋白43基因表达对大鼠成纤维细胞分化的生长特性及生物学功能影响

目的通过观察转染肌肉转录调节因子(myoblast determining,MyoD)基因和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因的大鼠成纤维细胞(fibroblast,FB)分化生长及生物学功能的改变,初步探讨MyoD和Cx43基因转染FB治疗缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的可能机制和途径。方法构建真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-MyoD和pLenti6/V5-DEST-Cx43,利用慢病毒表达系统,将MyoD和Cx43基因转入大鼠RFL-6FB;经终浓度为50μg/ml的Blasticidin进行筛选培养后,通过RT-PCR、Western blot等分子生物学手段确定MyoD和Cx43的转录和表达情况;借助免疫细胞化学、显微镜观察等手段对MyoD的肌肉特异性蛋白和Cx43连接蛋白进行检测,并观察转染后FB的生长情况。结果RT-PCR和Western blot检测出MyoD和Cx43基因转染后FB表达了相应mRNA及其蛋白,免疫细胞化学检测转染的FB细胞中Desmin、α-actin呈阳性表达。经分化培养基诱导,培养1周后,FB出现多细胞融合及肌管形成。结论MyoD及Cx43基因转染可改变FB的生物学特性,转向分化为成肌细胞,并能形成多核肌管及连接蛋白,形态学也得以证实,为进一步研究MyoD和Cx43基因转染FB治疗IHD提供了实验基础。

胎儿纤维连接蛋白与胰岛素样生长因子结合蛋白-1预测早产的临床应用

目的探讨胎儿纤维连接蛋白(fFN)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)在预测早产中的临床应用价值。方法选择先兆早产孕妇80例,高危早产孕妇70例,随机分为3组各50例,应用免疫测定法定性检测宫颈阴道分泌物中fFN和IGFBP-1的含量。A组行fFN检测,B组行IGFBP-1检测,C组行二者联合检测,通过与1周内分娩结局对照,计算3种方法的灵敏度、特异度、准确性、阳性预测值和阴性预测值,并相互比较。结果A组中13例fFN阳性,1周内分娩9例,37例阴性者中1周内分娩1例;B组中15例IGFBP-1阳性,1周内分娩10例,35例阴性者中1周内分娩1例;C组两者均阳性或两者之一阳性共13例,1周内分娩9例,37例两者均阴性孕妇中1周内分娩1例。三种检测方法比较上述指标差异无显著性。结论fFN和IGFBP-1均可单独应用作为预测早产的有效指标,但联合应用可最大限度提高阴性预测值。

重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域对骨髓基质干细胞黏附力的影响

目的:研究增强骨髓基质干细胞黏附力的方法。方法:去细胞猪主动脉瓣叶分别用纤维连接蛋白(Fn)和重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCTD64)及牛血清白蛋白(BSA)浸泡预涂处理12 h,对照组未预涂蛋白。采用间隔24 h、3次种植的方法种植骨髓基质干细胞(BMSCs),于种植后第8天进行细胞计数及MTT法检测比较去细胞瓣叶上黏附、增殖的细胞数量,同时取瓣叶进行组织学检测观察瓣叶表面BMSCs覆盖情况。结果:采用预涂Fn和FnCTD64后的去细胞猪主动脉瓣叶,预涂Fn组的细胞计数为(9.085±0.622)×104,MTT的吸光值为0.537±0.022;预涂FnCTD64组的细胞计数为(9.111±0.607)×104,MTT的吸光值为0.540±0.025;预涂BSA组的细胞计数为(4.593±0.464)×104,MTT的吸光值为0.360±0.018;对照组的细胞计数为(4.460±0.441)×104,MTT的吸光值为0.353±0.019;前两组明显高于后两组(P<0.01)。预涂Fn组和FnCTD64组无显著性差异。瓣叶经H-E染色,可见预涂Fn和FnCTD64组细胞覆盖情况优于预涂BSA组和对照组。结论:Fn和FnCTD64能明显增加BMSCs在去细胞猪主动脉瓣叶表面的黏附和增殖。

姜黄素对单核细胞趋化蛋白-1致系膜细胞增殖及纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的:观察姜黄素对单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)诱导大鼠系膜细胞增殖及纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)基因表达的影响。方法:采用不同浓度的姜黄素(6.25,12.5,25μmol/L)作用于MCP-1(100ng/ml)预处理的系膜细胞体外培养体系中,于不同的时间应用MTT法测定系膜细胞增殖活性,半定量RT-PCR的方法测定细胞FN和ColⅠmRNA的相对表达量。结果:随着姜黄素浓度的增高,作用时间的延长,姜黄素明显抑制MCP-1致系膜细胞的增殖、下调细胞FN和ColⅠmRNA的表达(P<0.01),表现为剂量和时间依赖性。结论:姜黄素抑制MCP-1诱导大鼠系膜细胞的增殖及细胞FN和ColⅠmRNA的表达。姜黄素在系膜增生性肾小球肾炎的治疗中起一定的作用。

纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽的制备及其对DIC大鼠的治疗作用

本研究利用酵母表达系统制备纤维连接蛋白(fibronectin,FN)N端肝素结合域多肽,检测多肽的生物学活性,进行多肽治疗DIC大鼠的实验研究。利用PCR技术从FNcDNA中扩增FN N端肝素结合域序列,将获得的目的基因片段克隆至T载体,筛选后转移至酵母表达pAo815SM载体进行选择,再构建重组酵母表达pPIC9K载体,线性化重组载体并转染GS115酵母细胞,在GS115酵母细胞表达目的多肽。发酵液经80%硫酸胺沉淀,沉淀物过S-100柱分离纯化,纯化物再经过SP柱纯化,测定多肽结合肝素等生物学活性。股静脉注射内毒素脂多糖(LPS)50mg/kg建立大鼠DIC模型。建立的DICSD大鼠40只,随机分2组,每组20只,一组为rhFNHN-29多肽治疗组,另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射LPS前半小时、注射后2小时、4小时尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg);生理盐水对照组注射等体积生理盐水。另设正常对照组SD大鼠20只,注射等体积生理盐水作为正常对照组。各组大鼠于股静脉注射LPS后6小时,对侧股静脉抽血测血常规,分离血浆检测血浆TNFa和凝血象。于注射LPS后72小时处死大鼠,取肝、肾、脾、肺、心、脑组织进行病理组织学检查。结果表明:成功地在酵母表达系中表达了目的多肽,其表达量达到30mg/L,所表达的多肽具有结合肝素活性。在多肽抗DIC作用的动物实验中发现多肽治疗组的血浆TNFa水平、血常规指标、凝血象和病理组织学的改变都较生理盐水对照组更接近正常对照组。结论:成功地制备了rhFNHN-29多肽,这种多肽能在一定程度上预防和治疗DIC。

单核细胞趋化蛋白-1对系膜细胞增殖及纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的观察单核细胞趋化蛋白1(MCP1)对体外培养的大鼠系膜细胞增殖及纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(COLⅠ)基因表达的影响。方法采用不同浓度的MCP1刺激体外培养的系膜细胞,于不同的时间应用MTT法测定系膜细胞增殖活性,半定量RTPCR的方法测定细胞FN和COLⅠmRNA的相对表达量。结果随着MCP1浓度的增高,刺激时间的延长,MCP1明显促进系膜细胞的增殖、上调细胞FN和COLⅠmRNA的表达(Ρ<0.01),表现为剂量和时间依赖性。结论MCP1能促进大鼠系膜细胞的增殖及上调细胞FN和COLⅠmRNA的表达。MCP1可能在系膜增生性肾小球肾炎的发病过程中起一定的作用。

宫颈胰岛素样生长因子结合蛋白-1与胎儿纤维连接蛋白的联合检测的临床价值

目的：通过在临床上使用胰岛素样生长因子结合蛋白-1/胎儿纤维连接蛋白检测试剂盒（胶体金法）与国外已上市的同类产品进行对比试验，对试剂盒快速诊断胎膜破裂和妊娠发动的有效性和适用性进行验证。方法招募前来产科就诊的18～40岁、孕周在22周以上（含22周）的孕妇，共开展284例临床试验。结果以进口试剂盒作为标准，国产在诊断胎膜破裂的Kappa一致性为0．9708（P＜0．0001）；在诊断妊娠发动的Kappa一致性为0．9920（P＜0．0001）。结论国产试剂盒在诊断胎膜破裂和妊娠发动方面与进口试剂盒的一致性极高。

重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人纤维连接蛋白(fibronectin,FN)羧基端细胞结合域的单克隆抗体,并以该抗体检测心脏瓣膜基质蛋白中FN蛋白的表达情况。方法:用RT-PcR方法获取人FN羧基端细胞结合域基因序列,通过pET32质粒表达获得TRX融合蛋白。并以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠后,按常规方法制备成单克隆抗体,获得分泌抗FN单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果:蛋白电泳结果显示,所获TRX融合蛋白条带与理论计算值相符,免疫动物后获得2株分泌抗FN羧基端细胞结合域不同位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型为IgC2a,免疫组化显示该抗体能特异性地结合人心脏瓣膜基质中的FN。结论:成功制备了分泌抗FN单克隆抗体,为FN结构、功能和机制的研究提供了有效工具。

生肌调节因子和连接蛋白43基因诱导大鼠成纤维细胞分化为肌细胞实验研究

目的探讨转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin,Cx43)基因的大鼠真皮成纤维细胞(der-mal fibroblast,DFs)生物学功能的变化及MyoD和Cx43基因转染DFs细胞治疗心力衰竭的可行性。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoD cDNA和Cx43cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western印迹法等方法检测MyoD及Cx43蛋白及mRNA表达情况,并且通过显微镜观察转染后生长情况,膜片钳技术检测离子电流变化。结果RT-PCR,Western印迹法检测出MyoD及Cx43蛋白及相应mRNA表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后培养1w细胞的融合现象,并有多核肌管形成。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。

探讨生肌调节因子和连接蛋白43基因在大鼠成纤维细胞中的表达

目的通过观察转染生肌调节因子(myoblast determination,MyoD)基因和连接蛋白43(Connexin)基因的大鼠真皮成纤维细胞(dermal fibroblast,DFs)生物学功能的变化,探讨Myo和Cx43基因转染DFs细胞的意义。方法采用Gateway技术,构建真核质粒表达载体,利用慢病毒(LV)表达系统,将大鼠MyoDcDNA和Cx43 cDNA转入大鼠成纤维细胞中,经Blasticidin筛选培养,通过RT-PCR,Western blot及膜片钳技术等方法检测MyoD及Cx43 mRNA及蛋白表达,并检测离子电流变化,通过显微镜观察转染后生长情况,免疫组织化学检测肌动蛋白和结蛋白的表达。结果RT-PCR,Western blot检测出MyoD及Cx43的mRNA及相应蛋白表达,膜片钳检测到转染后钙离子电流,显微镜观察到基因转染筛选后,培养1周细胞的融合现象,并有多核肌管形成。免疫组织化学检测可见其下游蛋白Desmin及α-actin呈现阳性表达。结论MyoD和Cx43基因转染使DFs分化为成肌细胞,为进一步研究基因治疗心力衰竭奠定基础。

纤维连接蛋白细胞结合区功能多肽在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白(FN)细胞结合区功能多肽(CBD),并对其进行纯化和鉴定。方法:经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞;用抗生素平板筛选重组杆粒,脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞并进行蛋白表达;经Ni-NTA层析柱对重组多肽进行纯化,对纯化的多肽行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果:得到融合6个组氨酸残基的FN-CBD,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为36000,Western-blot表明该多肽能与FN的多克隆抗体结合。结论:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能成功表达出人血浆FN-CBD,且表达产物具有良好的免疫原性,为后续结构、功能研究奠定了基础。

纤维连接蛋白基因型多态性与草酸钙肾结石相关性研究

目的:探讨纤维连接蛋白基因(FN)型多态性与草酸钙肾结石的关系。方法:用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测所有研究对象的FN第2内含子rs10202709位点及第26内含子rs35343644位点的基因型,探讨其基因型与草酸钙肾结石的关系。结果:FNAA基因型与草酸钙肾结石的发病率相关(P<0.05),未发现其他基因型与草酸钙肾结石有相关性。结论:FN基因型多态性与草酸钙肾结石有相关性,FN的AA基因型可作为肾结石患者草酸钙结石危险因素的标志。

细胞外基质纤维连接蛋白和层粘连蛋白在糖尿病大鼠视网膜微血管病变表达的研究

目的 探讨细胞外基质纤维连接蛋白 (FN )、层粘连蛋白 (LN )与糖尿病视网膜病变(DR)的关系。 方法 雄性Wistar大鼠 3 0只 ,随机分为糖尿病模型组 (DR组 ,n =2 0 )及正常对照组 (对照组 ,n =10 )。DR组大鼠腹腔注射链脲佐菌素 (STZ) 60mg/kg ,制备DR微血管病变模型。180d时处死大鼠 ,取外周血作血液流变学检查 ,眼球用 3 %胰酶消化 ,制成视网膜血管铺片 ,进行FN、LN免疫组织化学染色 ,并采用LEICA—Q550IW计算机图像分析系统定量分析FN、LN在视网膜微血管中的表达及分布。观察DR的形态学改变 ,计数内皮细胞与周细胞的比例。 结果 图像分析显示 :DR组FN、LN含量表达与对照组比较差异有显著意义 (P <0 0 0 1)。形态学观察 :DR组视网膜微血管周细胞减少、内皮细胞增生与对照组比较差异有显著意义 (P <0 0 0 1) ,毛细血管瘤、无细胞毛细血管形成 ,并有较多的白细胞栓塞血管腔。血液流变学检查 :血黏度、红细胞变形能力等改变与正常对照组比较差异均有显著意义 (P <0 0 5或 0 0 1)。 结论 细胞外基质中FN、LN的过度表达 ,介导细胞与细胞及细胞与间质之间相互作用 ,促进视网膜微血管内皮细胞增生、毛细血管瘤形成 ,并导致毛细血管闭锁、基底膜增厚等病理改变 。

纤维连接蛋白联合基因分型检测在预测乙肝进展、病程及转归中的作用

目的探讨纤维连接蛋白(Fn)和HBV基因分型(B型、C型、D型)的联合检测在肝病诊疗中的意义。方法对264例HBV感染患者采用单向免疫扩散法进行血清Fn的检测,并行荧光PCR检测;采用核酸测序法进行HBV基因分型(B型、C型、D型)检测,同时与200例健康体检者(对照组)的血清进行比较。结果 264例HBV感染患者中慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎患者的血清Fn与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);血清Fn下降最明显的是重度肝炎患者,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);急性肝炎、肝硬化以及肝癌患者血清Fn均明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。HBV基因型为B型患者共138例,C型患者46例,D型患者21例,B、D混合型患者59例。结论 Fn和HBV基因分型的联合检测能够比较客观地反映患者各项检测指标的达标情况,有助于对患者体内病毒的复制状态进行准确了解,进而为临床治疗提供方案。

c-erb-B_2、P_(53)癌基因蛋白在消化道癌症中的表达及其与癌组织微血管周围纤维连接蛋白的关系

用免疫组织化学标记法测定27例消化道癌症病人c-erb-B_2、P_(53)癌基因蛋白的表达。胃癌组(n=17)c-erb-B_2阳性率为70.59％,炎症溃疡对照组(n=9),阳性率为44.44％,健康人组(n=4)阳性率为0％。胃癌转移组(n=6)P_(53)表达的阳性率(0％)比胃癌无转移组(n=11)阳性率(54.55％)明显降低(P<0.05)。在两种癌基因的联合表达上,以c-erb-B_2(+)P_(53)(-)组最多(52.94％)。6例有转移的胃癌中癌组织间质微血管周围的Fn免疫荧光明显减弱,与c-erb-B_2表达间呈明显负相关(r=-0.8728,P<0.05)。重点讨论了上述变化与胃癌间的可能关系。

同源重组构建表皮葡萄球菌纤维蛋白原结合基因缺失突变菌株

目的构建表皮葡萄球菌(表葡菌)纤维蛋白原结合基因(fbe基因)缺失突变菌株,为fbe基因功能研究提供实验工具。方法采用同源基因重组技术。构建质粒ΔpBT2(含fbe::ermB基因),将其电转化进入金葡菌RN4220,再次抽提后电转化进入fbe基因阳性表葡菌(HB)中。将含有质粒ΔpBT2的表葡菌HB在5mg/L红霉素平板42℃经多次传代,使质粒ΔpBT2裂解,fbe::ermB基因同源重组到表葡菌HB的染色体上,通过红霉素耐药、氯霉素敏感等特性筛选出含有fbe::ermB基因的新表葡菌HB-ermB。结果经酶切鉴定后确认质粒ΔpBT2构建成功以及成功转导入金葡菌RN4220和表葡菌HB中,经PCR方法以及测序确认表葡菌HB的fbe基因缺失突变菌株HB-ermB构建成功。结论采用同源重组的方法完成了表葡菌HB的fbe基因缺失突变菌株的构建。

口腔肿瘤中转化生长因子β对纤维连接蛋白可变剪切区的调节作用

纤维连接蛋白(FN)广泛存在于细胞外基质中,其基因可在三个区域进行可变剪切。纤维连接蛋白可 变剪切区中的EDA和EDB在胚胎发育、创伤修复、尤其在肿瘤发生发展的过程中出现特异性高表达,与肿瘤的侵 袭和转移关系密切。目前发现转移生长因子(TGF-β)对上述可变剪切区具有一定调节作用。本文就纤维连接蛋 白可变剪切区在口腔肿瘤中的表达及TGF-β对FN可变剪切区的剪切调节情况做一综述。

表皮葡萄球菌纤维蛋白原结合基因分布的研究

目的 :研究不同来源的表皮葡萄球菌 (表葡菌 )以及其他葡萄球菌中纤维蛋白原结合基因 (fbe基因 )的分布情况。 方法 :采用聚合酶链反应 (PCR)方法检测表葡菌临床分离株或健康人群寄植株以及其他类型葡萄球菌的 fbe基因 ,并对fbe全基因序列进行了测序。结果 :临床分离的表葡菌中 fbe基因阳性率达到 84 .2 % ,健康人群来源的表葡菌中 fbe基因阳性率达92 .6 % ,而其他类型葡萄球菌中均未扩增出fbe基因 ;表葡菌 337# fbe基因全长序列为 345 7bp ,与国外文献报道对比有95 %同源性。结论 :fbe基因在表葡菌中广泛存在 ,fbe全基因序列与国外报道的结果相似。