纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染

基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV⁃5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV⁃11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强。本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV⁃5对造血细胞感染效率的变化。在前期构建的pKAd5f11p153R⁃EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入RGD4C肽或者gp120的V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG、F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG、F228CV⁃EG和F300CV⁃EG),以fiber未改造的HAdV5⁃EG和改造为F11p的F11p⁃EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率。结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5⁃EG感染效率最低,为2%;其次为F228CV⁃EG,感染率为45%;F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG和F300CV⁃EG感染率为85%~90%;F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG高于阳性对照病毒F11p⁃EG,三者分别为99%、99%、95%。各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5⁃EG明显低于F11p⁃EG、F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG,当MOI为100时分别为75%、93%、93%和96%。感染K562细胞的情况与U937细胞类似。各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD⁃EG和F300CV⁃EG的转导效率为28%和33%,是F11p⁃EG的10倍。对于人原代T细胞,F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG优于F11p⁃EG,当MOI为1000时,感染率分别为87%、90%和84%。研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV⁃5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV⁃11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点。

重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP的构建及其对UT-7/Epo细胞感染效率的检测

目的构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,并且研究该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo的感染效率及其在细胞中的复制。方法先通过分子克隆技术构建重组腺病毒质粒pAd5F11pTPEGFP,然后利用脂质体转染法,将其转染至HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的重组腺病毒。以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的重组腺病毒感染UT-7/Epo细胞,经流式细胞仪检测在不同感染复数(MOI)下荧光阳性细胞比例,即为Ad5F11pTPEGFP病毒对UT-7/Epo细胞的感染效率,同时将冻融后的重组腺病毒感染的UT-7/Epo细胞上清感染HEK293细胞,48 h后观察GFP在HEK293细胞中的表达。结果成功制备了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞的感染效率明显高于空载体对照病毒Ad5GFP,在MOI为200时,感染效率达98.2%,而空载体病毒在MOI为200时,对UT-7/Epo细胞的感染效率仅为29.7%。感染了重组腺病毒的UT-7/Epo细胞冻融上清感染新的HEK293细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞有较高的感染效率,并能在其中复制。

重组腺病毒Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系感染效率的比较研究

目的以Ad5-GFP及Ad5/F35-GFP为对照,评价Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系的感染效率。方法制备并纯化Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP及Ad5/F35-GFP三种重组腺病毒,以不同的感染复数(MOI)感染乳腺癌细胞系SKBR-3、MCF-7及肾癌细胞系786O。48 h后,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测感染效率及不同细胞表面柯萨奇腺病毒受体(CAR)、CD46和桥粒芯糖蛋白质2的表达。结果 Ad5/F35-GFP对SKBR-3、MCF-7及786O均具有很高的感染效率,且其在较低的MOI时就具有较高的感染效率;Ad5/F11p-GFP对CD46高表达的MCF-7及786O具有较高的感染效率,5 MOI感染即可达到60%以上的感染效率;而Ad5-GFP仅对CAR高表达的细胞系786O具有较高的感染效率,且感染效率随着MOI的增加而升高。Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP对三种肿瘤细胞系的感染效率明显高于Ad5-GFP。结论对5型腺病毒进行纤维顶球的改造,可增强对肿瘤细胞的感染效率。