大孔吸附树脂纯化羟基红花黄色素A的研究

[目的]探讨大孔吸附树脂对红花提取物的最佳纯化条件及纯化效果,为羟基红花黄色素A的工业化高效生产奠定基础。[方法]以羟基红花黄色素A（HSYA）作为考察指标,通过羟基红花黄色素A在6种商品化树脂上的吸附量和解吸率筛选树脂的种类,以收率和纯度为指标考察上样液的吸附流速、pH值及浓度,洗脱液的浓度、流速等纯化条件。[结果]采用HPD-400作为吸附树脂,50%乙醇作为洗脱液,pH值为3的红花提取液,上样吸附流速为6 BV/h,洗脱流速为8~10 BV/h时纯化效果较好,在该条件下HSYA的收率为73.8%,纯度为35.7%。[结论]大孔吸附树脂法优化纯化条件后,提高了羟基红花黄色素A的纯化效果,这为羟基红花黄色素A的工业化高效生产提供了理论依据。

羟基红花黄色素A干预脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞脂质运载蛋白2的表达

背景:缺血性脑卒中严重威胁人类健康,缺血缺氧后星形胶质细胞大量表达脂质运载蛋白2加重脑损伤,但其具体机制并不清楚。羟基红花黄色素A具有抗缺血、抗氧化、抗血栓及抗炎等作用,其是否影响脑缺血缺氧后星形胶质细胞表达脂质运载蛋白2,目前尚不清楚。目的:探究羟基红花黄色素A对脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞中脂质运载蛋白2表达的影响及机制。方法:(1)将30只成年SD大鼠随机分成3组:假手术组、大脑中动脉闭塞再灌注组、羟基红花黄色素A组,后2组建立大脑中动脉闭塞再灌注模型,羟基红花黄色素A组在再灌注后以12 mg/kg的剂量腹腔注射羟基红花黄色素A。采用Longa评分法评估神经功能缺损程度,采用TTC染色法测定脑梗死体积,Western blot和免疫荧光检测JAK2/STAT3通路及脂质运载蛋白2的表达,ELISA法检测白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平。(2)将星形胶质细胞分为4组:正常组、糖氧剥夺复糖氧组、羟基红花黄色素A组、AG490组,后3组建立糖氧剥夺复糖氧模型,在糖氧剥夺期间分别用75μmol/L羟基红花黄色素A、10μmol/L酪氨酸磷酸化抑制剂AG490处理星形胶质细胞8 h,进一步验证羟基红花黄色素A对脂质运载蛋白2的作用机制。结果与结论:(1)与假手术组相比,大脑中动脉闭塞再灌注组大鼠脑梗死体积明显增加,并伴有神经功能损伤加重(P<0.01),羟基红花黄色素A治疗可以减小脑梗死体积,改善神经功能(P<0.01);(2)大脑中动脉闭塞再灌注组p-JAK2、p-STAT3和脂质运载蛋白2的表达高于假手术组(P<0.01),羟基红花黄色素A治疗后抑制了p-JAK2、p-STAT3和脂质运载蛋白2的表达(P<0.01);(3)大脑中动脉闭塞再灌注组炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平高于假手术组(P<0.01),羟基红花黄色素A治疗后抑制了白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α表达(P<0.01);(4)体外实验糖氧剥夺复糖氧组p-JAK2、p-STAT3、脂质运载蛋白2的表达高于正常组(P<0.01),加入AG490后JAK2、STAT3磷酸化降低,脂质运载蛋白2表达被抑制(P<0.01)。结果表明,羟基红花黄色素A可能通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制缺血缺氧后星形胶质细胞中脂质运载蛋白2的表达,从而减轻脑损伤。

基于代谢组学和网络药理学探讨羟基红花黄色素A治疗脓毒症急性肝损伤作用机制

目的采用代谢组学与网络药理学方法探讨羟基红花黄色素A(HSYA)治疗脓毒症急性肝损伤作用机制。方法将50只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(10只)、脓毒症组(20只)和HSYA组(20只),采用盲肠结扎穿刺法构建脓毒症急性肝损伤小鼠模型,HSYA组造模后2 h皮下注射HSYA(2.25 mg/kg)。检测小鼠血清炎症因子含量及肝功能,HE染色观察肝组织病理变化,超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对肝组织进行代谢组学分析,多元数据统计方法筛选差异代谢物,采用网络药理学预测HSYA治疗脓毒症急性肝损伤潜在靶点,并对潜在靶点进行GO和KEGG通路富集分析,用Metabo Analyst 5.0数据库对模型组和HSYA组差异代谢物与潜在靶点进行匹配,构建靶点-代谢物-代谢通路网络,使用AutoDock Vina软件对HSYA与核心靶点进行分子对接,最后采用RT-qPCR验证核心基因表达。结果HSYA能降低模型小鼠血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量,恢复肝功能,减轻肝组织病理损伤。代谢组学筛选出26个向假手术组回调的差异代谢物,包括氟芬那酸、白叶藤碱、邻苯二甲酸、甲氰菊酯等,主要涉及不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢等5条代谢通路。网络药理学分析得到HSYA治疗脓毒症急性肝损伤潜在靶点81个,涉及2735个GO条目、124条信号通路;联合分析共匹配到5个差异代谢物,对应IL1B、STAT3、PTGS2、TP53等14个靶点参与HSYA对脓毒症急性肝损伤代谢紊乱的调控。分子对接结果显示,HSYA与IL1B、STAT3、PTGS2、TP53有良好的结合活性。RT-qPCR结果显示,HSYA能抑制肝组织IL1B、STAT3、PTGS2基因表达。结论HSYA可能通过调节IL1B、STAT3、PTGS2基因表达抑制炎症因子释放,维持机体代谢稳态,从而减轻脓毒症急性肝损伤。

基于脂质代谢组学研究羟基红花黄色素A治疗高脂血症LDLR^(-/-)小鼠的作用机制

[目的]基于脂质代谢组学方法考察羟基红花黄色素A(HSYA)对高脂饲料诱导的LDLR^(-/-)小鼠高脂血症脂质代谢的影响及其机制。[方法]将28只雄性LDLR^(-/-)小鼠分为对照组与高脂组。对照组喂养普通饲料,高脂组喂养高脂饲料,6周后,高脂组按照血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量平均分为4组:模型组、辛伐他汀组、HSYA(3.8 mg/kg)低剂量组、HSYA(7.6 mg/kg)高剂量组。给药11周,给药期间同时给予高脂饲料饲养。全自动生化仪检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、LDL-C含量,苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理形态,油红O染色观察小鼠肝脏组织脂肪蓄积情况,采用靶向脂质组学技术对LDLR^(-/-)小鼠血清中脂质进行测定。[结果]与对照组比较,模型组小鼠血清中LDL-C、TC、TG、AST、ALT含量升高(P<0.05),肝组织出现大小不等的脂滴浸润,肝细胞排列紊乱,大量脂质蓄积。与模型组比较,HSYA两组小鼠血清中LDL-C、TC、TG、AST、ALT含量降低(P<0.05),肝脏的脂肪变性、脂质蓄积等病理情况得到改善。脂质组学检测结果显示,模型组和对照组之间具有差异的脂质分子共有14种(VIP>1,P<0.05)。HSYA两组与模型组比较,17种脂质分子呈现相反的趋势并具有差异,分别为PE(18∶0/18∶1)、PE(18∶0/18∶2)、PE(18∶0/20∶3)、PE(18∶0/20∶4)、PE(O-18∶0/18∶1)、PE(O-18∶0/20∶4)、LPE(18∶1)、LPE(20∶4)、FFA(22∶4)、PI(18∶0/18∶2)、PI(16∶0/18∶1)、PI(18∶1/18∶1)、LPI(18∶0)、PG(18∶1/16∶1)、PG(18∶1/18∶1)、PG(18∶1/18∶2)、PA(18∶1/18∶1)(VIP>1,P<0.05)。[结论]研究利用脂质组学技术,发现HSYA可以通过调节高脂血症LDLR^(-/-)小鼠血清中脂质代谢水平,发挥治疗高脂血症的作用,为临床应用HSYA提供了新的参考依据。

Box-Behnken响应面法优化羟基红花黄色素A纳米粒处方工艺及体外释放评价

目的优化羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)纳米粒制备工艺,并对其进行体外释放评价。方法以乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA]为载体,利用改良的复乳法制备HSYA纳米粒,通过Plackett-Burman设计实验联用Box-Behnken响应面法优选最佳制备工艺;利用粒径测定仪、TEM扫描电镜仪、傅里叶红外光谱(FT-IR)仪、X-射线粉末衍射(XRD)仪对纳米粒进行表征;并对其进行4℃储藏稳定性、生理介质中稳定性、冻干保护剂及体外释放率考察。结果优选出纳米粒最佳工艺处方为:pH为6.95,投药量为2.8 mg,载体用量为18.2 mg;在此条件下制备出的纳米粒粒径为(176.4±1.29)nm,多分散系数(Polydiseperse Index,PDI)为(0.152±0.014),Zeta电位为(-17.6±0.46)mV,包封率为(78.5±0.49)%,载药量为(7.3±0.07)%,纳米粒形态圆整,分散性好;在4℃储存环境下、不同生理介质中稳定性良好,最佳冻干保护剂为1%葡萄糖;纳米粒48 h体外释放率为85%。结论该优化方法合理可靠,所得纳米粒稳定性良好,具有一定的缓释作用,体外释放符合一级动力学模型。

羟基红花黄色素A对实验性自身免疫性肝炎小鼠的保护作用

目的 利用刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导的肝损伤小鼠模型,研究羟基红花黄色素A(hydroxylsafflor yellow A,HSYA)对实验性自身免疫性肝炎小鼠的保护作用。方法 36只BALB/c小鼠随机分为6组,Sham组、Con A组、HSYA低剂量组(5 mg/kg)、HSYA中剂量组(10 mg/kg)、HSYA高剂量组(20 mg/kg)、Sham+HSYA高剂量组(20 mg/kg),每组小鼠各6只。将各组小鼠称质量并记录,通过腹腔注射给药的方式对其进行3 d HSYA预处理,处死小鼠前12 h,尾静脉注射Con A,制作实验性自身免疫性肝炎小鼠模型,最终以二氧化碳吸入法处死小鼠并取材备用。使用全自动生化分析仪检测各组小鼠血浆AST和ALT水平,并进行组间比较。肝组织进行苏木精-伊红染色,镜下观察肝脏组织学变化。应用ELISA检测血浆中TNF-α、 IL-17、IL-10水平。结果 Con A组小鼠体内TNF-α、 IL-17、IL-10水平(F=21.19、F=13.12、F=3.209,P均<0.05)及ALT、AST水平(F=274.33、F=214.91,P均<0.05)高于Shan组,并伴有肝细胞大片坏死。HSYA中剂量和HSYA高剂量组小鼠体内炎症因子水平及氨基转移酶水平低于ConA组,同时伴肝细胞坏死区域缩小。结论 Con A成功诱导小鼠肝组织损伤,HSYA对实验性自身免疫性肝炎小鼠具有保护作用。

HPLC法测定参梅养胃颗粒(无蔗糖)中羟基红花黄色素A的含量

目的:建立HPLC法测定参梅养胃颗粒(无蔗糖)中羟基红花黄色素A的含量。方法:采用色谱柱ODS-C_(18)(4.6 mm×250 mm, 5μm);以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相等度洗脱;检测波长403 nm;柱温25℃;进样量10μL;流速1.0 mL/min。结果:羟基红花黄色素A在0.0480~0.7196μg范围内线性关系良好,平均加样回收率(n=9)为101.74%, RSD值为1.6%。结论:该方法操作简便、准确、重复性好,测定结果稳定,可以作为参梅养胃颗粒(无蔗糖)中羟基红花黄色素A的含量测定方法。

羟基红花黄色素A抑制血管紧张素Ⅱ介导的心脏成纤维细胞肌化

目的研究羟基红花黄色素A对血管紧张素Ⅱ介导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。方法实验细胞随机分为正常对照组、Ang-Ⅱ组、Ang-Ⅱ+HSYA(5μM)组、Ang-Ⅱ+HSYA(25μM)组、Ang-Ⅱ+HSYA(50μM)组和Ang-Ⅱ+HSYA(100μM)组。使用划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测细胞迁移侵袭情况,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)水平,Western blot检测α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ及转化生长因子β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)的蛋白表达水平。结果Ang-Ⅱ促进心脏成纤维细胞迁移、增加ROS产生;而HSYA抑制了Ang-Ⅱ介导的心脏成纤维细胞迁移以及ROS产生;Western blot发现HSYA抑制了Ang-Ⅱ介导的心脏成纤维细胞α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ及TGF-β1的蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论HSYA通过减少ROS的产生和下调TGF-β1信号通路抑制Ang-Ⅱ诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。

高效液相色谱法同时测定跌打活血散中羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量

目的:建立跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量测定方法。方法:以Agilent ZORBAXSB-C8柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)为色谱柱,乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃(18:80:2)为流动相,检测波长为340 nm,流速为1.0 ml/min,柱温为30℃。结果:羟基红花黄色素A在40.2~201.0 μg/mL浓度范围内线形关系良好,r = 0.9995 (RSD = 1.6%, n = 5),平均回收率为96.2% (RSD = 1.3%, n = 6);阿魏酸在1.01~5.05 μg/mL浓度范围内线形关系良好,r = 0.9997 (RSD = 1.1%, n = 5),平均回收率为98.6% (RSD = 1.5%, n = 6)。结论:本方法简便、准确,结果稳定,可用于跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素A和阿魏酸的测定。

羟基红花黄色素A对脑组织蛋白质硝基化及对损伤侧脑组织保护作用的研究

目的探究羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)通过细胞实验及动物实验对损伤侧脑组织的保护作用,观察ONOO-及Heme/NaNO_(2)/H_(2)O_(2)途径对脑组织蛋白硝基化以及HSYA的影响,探讨HSYA对损伤脑组织的保护作用。方法选取30只SD大鼠分为正常组(Control组)、模型组(Model组)及HSYA干预组(HSYA组)。采用Western blot检测3-NT蛋白表达水平,通过细胞实验观察HSYA对脑缺血再灌注损伤诱导的脑组织蛋白质硝基化、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达情况的影响,初步探讨HSYA对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。选取120只SD大鼠分为假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注模型组(CIRI组)及HSYA治疗组(HSYA+CIRI组)。通过改良线栓法制备大鼠脑梗死模型,采用免疫组化及Western blot检测3-NT蛋白表达水平,使用ABTS法检测T-AOC,使用ELISA法检测CAT、SOD及GSH-Px。结果经细胞实验发现ONOO-及Heme/NaNO_(2)/H_(2)O_(2)途径均可增加脑组织中3-NT且经HSYA预处理后对3-NT具有明显抑制作用。HSYA组脑组织中3-NT含量明显低于Model组(P<0.05)。经动物实验发现HSYA具有改善CIRI后脑组织的损伤,降低3-NT蛋白表达,升高T-AOC、CAT、SOD及GSH-Px在脑组织内中含量,对损伤侧脑组织具有保护作用。HSYA+CIRI组损伤侧脑组织中3-NT蛋白含量明显低于CIRI组(P<0.05),损伤侧脑组织中3-NT阳性细胞数明显低于CIRI组(P<0.05),损伤侧脑组织中T-AOC、CAT、SOD及GSH-Px含量明显高于CIRI组(P<0.05)。结论HSYA可抑制ONOO-及Heme/NaNO_(2)/H_(2)O_(2)途径在体外对脑组织蛋白硝基化的修饰作用,且HSYA可抑制损伤侧脑组织中3-NT含量,提高T-AOC、CAT、SOD及GSH-Px含量,具有较强抗氧化作用。

羟基红花黄色素(HSYA)纯化条件的影响

目的探讨纯化羟基红花黄色素A(HSYA)的影响因素。方法用HPLC法测定,以HSYA百分含量为指标,考查醇沉浓度,药液浓度及pH值对HSYA纯化的影响。结果醇沉浓度对HSYA的纯化影响较大,其次为药液浓度和pH值,而且先调pH值后醇沉得到的HSYA含量更高。结论80%的乙醇沉淀,药液浓度为料液比2∶1,pH值为6.5,是最佳工艺条件。

羟基红花黄色素A对脂多糖诱导抑郁模型大鼠的影响

目的:通过脂多糖(LPS)诱导建立大鼠抑郁模型,研究羟基红花黄色素A的抗抑郁作用。方法:腹腔注射LPS建立大鼠抑郁模型,设置正常对照组、模型组、阳性对照组和羟基红花黄色素A不同剂量给药组,评价大鼠抑郁样行为,检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、BDNF和5-HT含量,观察海马组织病理学变化,检测TLR/NLR信号通路蛋白表达情况。结果:与抑郁模型组相比,羟基红花黄色素A各剂量组大鼠水平运动、垂直运动及糖水偏好率增加,悬尾和游泳不动时间减少(P<0.01);血清BDNF、5-HT水平升高,TNF-α、IL-1β及IL-6水平下降(P<0.01);海马组织TLR2、NLRP1、NLRP3、ASC、TLR4和Caspase-1蛋白表达水平均降低(P<0.01)。结论:羟基红花黄色素A可改善LPS诱导的大鼠抑郁样行为,其机制可能与抑制TLR/NLR信号通路有关。

羟基红花黄色素A通过MAPK/ERK信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织损伤的保护作用

目的探究羟基红花黄色素(HSY)A通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对去卵巢骨质疏松(OP)大鼠骨组织损伤的保护作用。方法将SD大鼠分为假手术组、模型组、阿仑磷酸钠组(1.5 mg/kg阿仑磷酸钠)、HSYA-L组(2.5 mg/kg HSYA)、HSYA-M组(5 mg/kg HSYA)和HSYA-H组(10 mg/kg HSYA),每组10只,切除卵巢构建绝经后OP(PMOP)大鼠模型,术后1 w阿仑磷酸钠组、HSYA-L组、HSYA-M组、HSYA-H组分别灌胃相应剂量药物,假手术组、模型组灌胃等量生理盐水;双能X线吸收扫描仪检测大鼠骨密度(BMD);酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG)含量;测定骨组织生物力学指标;苏木素-伊红(HE)染色观察骨组织病理学情况;实时荧光定量PCR检测骨组织RANKL和OPG mRNA表达水平;Western印迹检测骨组织MAPK/ERK通路蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组股骨上下端及股骨BMD、血清OPG含量及mRNA表达水平、股骨最大载荷、最大应力和刚度显著降低,血清RANKL含量及mRNA表达水平和RANKL/OPG比值、骨组织病变程度、p-c-fos/c-fos和p-ERK1/2/ERK1/2水平显著增加(P<0.05);与模型组相比,阿仑磷酸钠组、HSYA-L组、HSYA-M组、HSYA-H组股骨上下端及股骨BMD、血清OPG含量及mRNA表达水平、最大载荷、最大应力和刚度显著增加,血清RANKL含量及mRNA表达水平和RANKL/OPG比值、骨组织病变程度、p-c-fos/c-fos和p-ERK1/2/ERK1/2水平显著降低(P<0.05),存在HSYA剂量依赖性;与阿仑磷酸钠组相比,HSYA-H组各指标无显著性差异(P>0.05)。结论HSYA对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织损伤的保护作用可能与其抑制MAPK/ERK通路有关。

基于蛋白组学探讨羟基红花黄色素A对急性肝损伤的作用机制

目的基于蛋白组学的方法探讨羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA)对急性肝损伤(acute liver injury,ALI)的作用机制。方法将雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、四氯化碳(CCl 4)模型组和羟基红花黄色素A低、中、高剂量组[10、20、40 mg/(kg·d)],每组10只。正常对照组、模型组腹腔注射生理盐水,羟基红花黄色素A组按不同浓度腹腔注射给药,持续8天。第8天给药后的1小时,其余组大鼠一次性腹腔注射50%CCl 4花生油溶液(0.1 mL/100 g)建立ALI模型,正常对照组注射等体积的花生油。24小时后解剖计算大鼠肝脏系数;检测大鼠血清肝功能指标[丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)]含量、氧化指标[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)]以及炎症因子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)]的表达水平;并采用苏木素—伊红(HE)染色进行组织病理学观察;利用串联质谱标签技术(tandem mass tag,TMT),筛选正常对照组、模型组和羟基红花黄色素A各剂量组之间的差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs),并借助Uniprot数据库以及微生信在线工具等对其进行GO和KEGG富集分析。结果(1)与正常对照组相比,模型组大鼠肝脏系数、肝功能指标、MDA含量以及促炎因子表达水平均显著升高(P<0.05),SOD活力显著降低(P<0.05);与模型组相比,羟基红花黄色素A各剂量组大鼠肝脏系数、中高剂量组ALP含量以及各剂量组ALT、AST、MDA含量和促炎因子的表达水平均显著降低(P<0.05),SOD活力显著升高(P<0.05)。(2)模型组与正常对照组共筛选出243个DEPs,其中上调蛋白188个,下调蛋白55个;羟基红花黄色素A各剂量组与模型组共筛选出104个DEPs,其中上调蛋白37个,下调蛋白67个(FC>1.3,P<0.05)。(3)GO分析显示:DEPs主要涉及胞质囊腔、细胞外液、内质网等细胞组分,涉及免疫球蛋白受体结合、抗氧化活性、辅因子结合等分子功能,涉及炎症反应、氧化应激、脂质合成与代谢等生物过程。(4)KEGG分析显示:DEPs主要富集于脂肪酸代谢、PPAR等通路。结论羟基红花黄色素A可以保护CCl 4所致的ALI,其机制可能通过ME1、CYP4A1、PPAR等多个靶点和信号通路来发挥保肝护肝的作用。

羟基红花黄色素A抗缺氧/复氧所致神经元损伤的作用及机制研究

[目的]考察羟基红花黄色素A(HSYA)抗缺氧/复氧(H/R)损伤神经元的作用及机制。[方法]原代培养Wistar大鼠胎鼠皮层神经元,将神经元随机分为正常对照组、H/R组、羟基红花黄色素A低(5μg/mL)、中(20μg/mL)、高(80μg/mL)剂量组,考察HSYA对神经元活力和乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测脑源性神经生长因子(BDNF)、生长相关蛋白43(GAP-43)及Nogo-A等与神经元突触重塑相关指标的mRNA和蛋白表达。[结果]与正常对照组比较,H/R组细胞活力明显降低,LDH释放明显增加(P<0.01),BDNF及GAP-43 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05),Nogo-A mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01);与H/R组比较,HSYA低、中、高3个剂量组细胞活力均显著增强,LDH释放明显减少(P<0.01),BDNF及GAP-43 mRNA及蛋白表达明显增加,Nogo-A mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。[结论]HSYA能够提高神经元活力,减少LDH释放,具有抗H/R所致神经元损伤的作用,该作用与促进BDNF表达有关;此外,HSYA还能促进GAP-43 mRNA和蛋白表达、抑制Nogo-A mRNA和蛋白表达,从而增加神经元突触可塑性。

电子加速器辐照对红花粉末及水提液微生物及羟基红花黄色素A含量的影响

为考察电子加速器辐照对红花粉末及水提液中微生物和羟基红花黄色素A含量的影响,分别选用0、4、6、8、10 kGy辐照剂量对红花粉末和红花水提液进行辐照灭菌处理,比较辐照前后红花粉末和红花水提液性状、显微特征、薄层色谱图、主要有效成分羟基红花黄色素A含量,以及细菌总数、霉菌和酵母菌总数及大肠菌群变化。结果表明,不同剂量电子束辐照前后红花粉末和红花水提液性状未见明显变化。与辐照前相比,辐照后红花粉末的显微特征、薄层色谱图以及羟基红花黄色素A含量未见显著改变(P>0.05),辐照后红花水提液的羟基红花黄色素A含量整体存在显著差异(P<0.05),辐照后红花粉末和水提液的细菌总数、霉菌和酵母菌总数均显著下降(P<0.05)。当辐照剂量达到10 kGy时,红花粉末和红花水提液细菌总数、霉菌和酵母菌总数及大肠菌群符合2020版《中华人民共和国药典》规定的标准。综上所述,电子加速器辐照适用于红花粉末的灭菌,但不适用于红花水提液的灭菌。本研究为红花药材、含红花药材及红花提取物的成药辐照灭菌提供了参考。

羟基红花黄色素A体外消化特性与体内代谢规律研究

目的研究羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)体外模拟胃肠道系统中的稳定性,口服后小鼠组织中的分布,以及HSYA跨小肠上皮细胞膜运输能力。方法体外模拟胃肠道消化实验采用紫外分光光度法检测体外模拟胃肠道消化分别为1和2h后的HSYA的全光谱特性以及高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定HSYA的含量,动物实验包括3种不同摄入方式:腹腔注射、灌胃及长期饲喂。腹腔注射和灌胃给药方式分别有两个时间点:1和2 h,剂量为0.01 mL/g;长期饲喂方式为含有2.5%红花小花饲喂10周,采集小鼠组织,样品处理采用6%高氯酸和甲醇沉淀蛋白法,利用HPLC测定样本中HSYA的含量。HSYA与小肠上皮细胞共培养不同时间后,吸取培养液,把细胞裂解后,通过HPLC测定培养液和裂解后的HSYA含量。结果体外消化实验结果表明,胃、肠道消化后的HSYA结构未被破坏,HSYA在胃肠道的稳定性较好;腹腔注射红花水提物后HSYA在小鼠血清、肝脏、肾、肺中的含量随着时间延长而下降,只有肌肉中HSYA的含量随着时间的延长而升高,而脾、睾丸、脑、心中均未检测到HSYA。灌胃和长期饲喂红花水提物后小鼠组织和血清中未检测到HSYA,表明HSYA无法经口服被吸收入血。通过细胞实验进一步证明了HSYA无法透过小肠上皮细胞而实现跨膜转运。结论本研究证明了HSYA在胃肠道中的稳定性较好,但口服后不能跨过肠道屏障被吸收入血;HSYA以注射方式入血后在组织中的分布存在一定差异。

红花中羟基红花黄色素A的提取纯化工艺研究

目的:优化红花中羟基红花黄色素A(HSYA)的提取纯化工艺。方法:以羟基红花黄色素A的提取率为考核指标,采用正交试验设计对红花提取工艺参数进行考察,进而考察大孔树脂对羟基红花黄色素A的纯化。结果:红花提取工艺条件是20倍量水浸泡40min;再采用HPD100大孔树脂对羟基红花黄色素A纯化,得到纯度较高的HSYA。结论:优选羟基红花黄色素A的提取纯化工艺操作简单、科学合理,可用于其单体及制剂的制备。

基于p38MAPK/SERCA2α通路观察羟基红花黄色素A对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

目的:基于p38丝裂原活化蛋白激酶/肌质网Ca^(2+)-ATP酶2α(p38MAPK/SERCA2α)通路观察羟基红花黄色素A(HSYA)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)的保护作用。方法:120只SD雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、HSYA 5 mg/kg组、HSYA 10 mg/kg组、HSYA 20 mg/kg组及p38MAPK信号通路抑制剂组(SB203580组)。5、10、20 mg/kg HSYA组大鼠分别灌胃给予对应剂量HSYA,SB203580组给予100µg/kg SB203580,末次灌胃结束后制作MIRI模型,Sham组仅切开左胸暴露心脏不结扎。缺氧4 h、复氧12 h建立H9C2心肌细胞OGD/R损伤模型并分为6组:对照组(Control组)、缺氧复氧模型组(OGD/R组)、5、10、20µmol/L HSYA组及SB203580组,Control组、OGD/R组不进行药物干预。TTC染色测定大鼠心肌梗死面积;超声心动图检测大鼠心脏功能;HE染色观察大鼠心肌组织病理学改变;Annexin V-FITC/PI双染法检测大鼠心肌组织和H9C2细胞凋亡;检测大鼠血清氧化应激及心肌酶指标;ELISA检测大鼠心肌组织和H9C2细胞炎症因子含量;CCK8及EdU染色检测H9C2细胞增殖能力;qRT-PCR检测心肌组织和H9C2细胞p38MAPK、SERCA2αmRNA表达;Western blot检测大鼠心肌组织和H9C2细胞p38MAPK、p-p38MAPK、SERCA2α、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达。结果:10µmol/L或10 mg/kg HSYA能够提高左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、Bcl-2、SERCA2α水平,降低肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低Bax、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、丙二醛(MDA)、TNF-α、IL-1β、IL-6、p-p38MAPK/p38MAPK水平,促进心肌细胞增殖,抑制细胞凋亡,减少心肌梗死面积,改善心肌损伤。结论:HSYA能够抑制心肌细胞凋亡、氧化应激及炎症,从而减轻MIRI,其机制可能与p38MAPK/SERCA2α信号通路有关。

HPLC法测定藏药十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的含量

目的建立十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的含量测定方法。方法采用UItimate XB-C_(18)(4.6 mm×250mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.7%磷酸(三乙胺调节pH6.0)(27:73)为流动相,流速为1.0ml/min,进样量为10μl,检测波长403 nm,柱温25℃。结果羟基红花黄色素A在23.4411~195.3424μg/ml范围内呈线性(r=0.9996);平均回收率(n=6)为99.9%,RSD为1.4%。结论该方法灵敏度高,重复性好,测定结果准确,可用于十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的测定。