纳升液相色谱-高分辨串联质谱研究冻存条件对唾液多肽组的影响

唾液多肽组学为疾病相关的生物标记物研究提供了新方法,但冻存条件对分析结果的影响并不清楚。本研究采用氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料分离富集唾液多肽,利用纳升液相色谱-高分辨串联质谱技术,考察唾液样品分别置于-80℃与-20℃冻存6个月后对唾液多肽组的影响。结果表明,在-80℃冻存条件下的唾液样品中,共鉴定出归属于33种蛋白的429条肽段;在-20℃冻存条件下的唾液样品中,鉴定出595条肽段,对应31种蛋白。实验结果表明,相比于-80℃,唾液置于-20℃条件下的新增加肽段主要来源于已有肽段的降解,并且唾液中的蛋白质也发生了一定降解。本研究在肽段序列水平上考察了冻存条件对多肽的影响,结果表明,-20℃冻存条件不适合长期保存用于多肽组分析的唾液样品。本研究结果可为相关医学研究提供借鉴。

纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰

多肽组是指生物体表达的所有多肽,尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源。本研究采用氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多肽,进行纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析,从单一样本中鉴定了归属于123个蛋白质的790条肽段。研究表明,这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的。此外,本研究检测到了肽段的氧化、磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象,观察到了尿液多肽的阶梯序列性,从蛋白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析,结果表明,这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作用。本方法可为在尿液中寻找疾病的标志物提供方法学支持。

纳升液相色谱-高分辨串联质谱研究不同分离方法对唾液外泌体蛋白质组的影响

外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 m L唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 m L唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。

人唾液蛋白质组的纳升液相色谱-高分辨串联质谱鉴定及高丰度蛋白质分析

常规的定性分析质谱数据能否以及如何应用于蛋白质组学的相对定量分析是实际工作中经常遇到的问题。本研究采用一维纳升液相色谱-高分辨串联质谱(nano-HPLC-Triple TOF 5600)法鉴定人唾液蛋白质组,并分析其基本组成,以探讨质谱数据与唾液中高丰度蛋白质的相关性。本实验共鉴定了6 044条特异性酶切肽段,归属于α-淀粉酶1、碳酸酐酶6、血清白蛋白、粘蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和免疫球蛋白等各种已知的高丰度蛋白质在内的521个蛋白,这为一维纳升液相色谱分离条件下的唾液蛋白质组的基本组成分析提供了参考。结果表明,仅用蛋白质排序指标Unused值表征蛋白质的相对含量具有局限性,而蛋白质排序、检出肽段数目和肽段平均强度等综合指标与蛋白质相对含量具有正相关性,即排名较后的蛋白质均只有1条肽段被检出,且肽段强度较低。这说明,当蛋白质相对含量差别较大时,肽段的化学性质和电离效率差异对质谱信号的影响已不占主要地位,即可以认为当肽段检出数目、鉴定覆盖率和肽段强度均较低时,蛋白质的相对含量也较低。该结果可为利用Triple TOF 5600质谱仪的定性鉴定数据进行初步半定量判断提供参考,也可为唾液蛋白质组生物标志物研究提供借鉴。

超高效液相色谱-串联高分辨质谱法检测人体尿液中的对苯二胺-醌类新污染物

该文建立了一种基于液液萃取的超高效液相色谱-串联高分辨质谱测定人体尿液中5种新污染物对苯二胺-醌(PPD-Qs)的方法。优化确定了样品前处理条件及色谱、质谱仪器参数,并采用氘代N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺醌(6PPD-Q-D5)作为内标进行定量分析。结果表明,该方法在0.01~50 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数大于0.999,方法检出限低至2.4~7.5 pg/mL。尿液中5种PPD-Qs的基质效应为81.3%~110%;3种不同浓度水平加标样本的平均回收率为80.5%~114%,日内及日间相对标准偏差(RSD)均不大于11%。将该方法应用于人群队列尿液中5种PPD-Qs的检测,5种PPD-Qs的平均质量浓度为0.04~1.06 ng/mL。该方法操作简单、灵敏度高、重复性好,适用于人体尿液中新污染物PPD-Qs的检测。

液相色谱-串联高分辨质谱法测定土壤和沉积物中17种全氟化合物

建立了超声提取-固相萃取/液相色谱-串联高分辨质谱同时测定土壤和沉积物中17种全氟化合物的检测方法。通过设计提取溶剂、超声温度、超声时间和超声次数对全氟化合物提取效率的正交试验,确定最优前处理条件为:样品过80目筛,在30℃下用甲醇超声提取30min,分离上清液并浓缩至1~2mL,加纯水稀释至200mL后过PWAX固相萃取柱净化,再用0.05%氨水-甲醇溶液进行洗脱,洗脱液浓缩定容后用AcclaimTM VANQUISH C18柱以2mmol/L乙酸铵溶液和乙腈为流动相进行梯度分离,高分辨质谱全扫描定量分析。结果表明,17种全氟化合物在1.0~20.0μg/L质量浓度范围内线性良好,相关系数r在0.997~0.9999范围内,方法检出限为0.1~0.3μg/kg,测定下限为0.4~1.2μg/kg,样品的加标回收率为96.8%~127%,相对标准偏差为0.8%~9.1%。该方法具有高效、灵敏、准确等优点,可同时监测土壤和沉积物中17种全氟化合物。

基于超高效液相色谱-串联高分辨质谱的血清代谢组学用于探索区分结直肠腺瘤和结直肠癌的生物标志物

结直肠腺瘤(Colorectal adenoma,CA)发展成为结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一个相对漫长而隐匿的过程,然而,目前仍缺乏微创且可靠的生物标志物来区分CA和CRC患者。该文采用超高效液相色谱-串联高分辨质谱(UHPLC-HRMS)技术结合多元统计分析方法对64例CA患者和84例CRC患者的血清样本进行代谢组学比较分析,结合P<0.05和倍数变化>1.50或<0.67筛选两者的血清差异代谢物,并通过受试者工作特征曲线(ROC)分析考察其对CA和CRC的鉴别能力。同时利用差异代谢物的通路及富集分析初步探索CA癌变的代谢机制。结果表明,两组的血清代谢谱存在差异,据此筛选并鉴定获得66种组间差异代谢物,主要涉及不饱和脂肪酸的生物合成、嘌呤代谢、亚油酸代谢,提示其可能与CA癌变有关。此外,PC 36∶3、腺嘌呤、鞘氨醇、PC 18∶0、PC 20∶4标志物组合的ROC曲线下面积为0.941,对CA和CRC表现出良好的判别效能,可为CRC的临床早期预防提供有价值的参考。

基于液相色谱-高分辨质谱非靶向筛查技术的食物中毒应急检测

目的对1起食物中毒样品中可疑致病因子进行应急筛查,并定性、定量测定。方法可疑物样品经提取净化处理后,采用液相色谱-高分辨质谱联用技术,基于质谱一级全扫描数据和二级扫描数据对样品进行筛查,发现可疑化合物后,利用标准物质进行确证,外标法定量测定。结果利用气相色谱质谱联用仪扫描得到SCAN图谱,通过NIST标准谱库定性检索,未见其他可疑致病化合物。液相色谱-高分辨质谱筛查技术在自制酱料、制成菜和病例呕吐物中检出可疑化合物为蟾蜍色胺,用液相色谱-串联三重四极杆质谱技术定量检测,该3类样品中蟾蜍色胺质量浓度分别为56.7、49.4、0.59μg/kg。结论液相色谱-高分辨质谱非靶向筛查技术可用于应急样品中可疑化合物的发现和确证,为现场处置提供实验室证据支持。

超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白

采用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白进行了分析。样品经胰蛋白酶酶切后,进行液相色谱-串联质谱分析和数据库检索。结果表明,分别有5个和7个肽段匹配于人肿瘤坏死因子受体和人Iggamma-1chainCregion。比对分析表明,重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白中检测到的人IgG的7个肽段完全与人IgG1的序列匹配,与其它3个亚型只有部分肽段匹配。说明重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白一级结构正确,Fc片段确实为人IgG1的Fc片段。

基于纳升高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱超高分辨质谱技术研究脑心通胶囊中动物药的蛋白质

目的建立脑心通胶囊中动物药的蛋白质类成分的分析方法。方法以脑心通胶囊及其投料所用的地龙、水蛭、全蝎动物药材(分别对应通俗环毛蚓Metaphire vulgaris Chen、宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、东亚钳蝎Mesobuthus martensii Karsch)为研究对象,采用SDS-PAGE电泳技术分离脑心通胶囊及3味动物药材的总蛋白,并进行胶内酶解,同时对脑心通胶囊和全蝎药材的总蛋白进行直接酶解;利用纳升高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱超高分辨质谱技术研究脑心通胶囊中的蛋白质。采用Proteome Discoverer软件,检索环节动物门(Annelida.fasta)和节肢动物门(Arthropoda.fasta)蛋白质数据库以鉴定蛋白质。结果在9批脑心通胶囊中有5个清晰的蛋白质条带稳定重现,其相对分子质量分别在45、40、30、25、20 kDa左右。在脑心通胶囊总蛋白中共鉴定到28个与动物药相关的蛋白质,这些蛋白质大多与细胞结构、能量代谢、物质运输有关。对胶囊SDS-PAGE中5个条带的蛋白质分别进行分析,各个条带中部分蛋白质可对应归属到3味动物药材;且新鉴定得胍乙基磷酸丝氨酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等蛋白质,前者可能与抗凝血或溶栓活性有关。结论基于超高分辨质谱技术及蛋白质组学的研究方法用于脑心通胶囊中3种动物药的蛋白质分析,本研究弥补了脑心通胶囊中蛋白类成分研究的空白,为阐明其动物药的物质基础以及进一步研究该胶囊药效与物质基础关联性提供了科学支持。

分散固相萃取-超高效液相色谱-串联高分辨质谱法测定新疆苹果中7种农药残留

为快速得到新疆苹果中痕量农药信息,考察新疆苹果种植过程中常用的7种农药,并针对这7种常见农药建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联高分辨质谱的分析方法,旨在快速筛查出可能的农药并同时定量。结果表明:7种农药线性关系良好,相关系数均大于0.99。方法检出限为0.003～0.1 mg/kg,定量限为0.02～0.5 mg/kg,平均回收率为95%～119%之间,相对标准偏差小于10%(n=3)。该方法能够排除假阳性结果,快速高效地完成出口前新疆苹果中多农药残留的分析。

液相色谱-串联高分辨质谱测定鸡肉中卡巴氧、喹乙醇的代谢物残留

本研究建立了鸡肉中卡巴氧、喹乙醇的代谢物残留的液相色谱-串联高分辨质谱测定方法。鸡肉样品经酸解后,固相萃取净化,液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱测定,稳定同位素内标定量。卡巴氧、喹乙醇的代谢物喹喔啉-2-羧酸、3-甲基-喹喔啉-2-羧酸在0.5μg/kg^10 g/kg范围内线性关系良好,最低定量限0.5μg/kg,检测限0.2μg/kg。高中低浓度精密度<20%(RSD%),平均回收率70%~120%。经实际样品的测定,本方法简便、实用,适宜于大批量样品的测定。

超滤法结合纳升液相色谱-串联质谱技术分析漏出性胸腔积液中多肽组分

漏出性胸腔积液中的多肽和蛋白质等生物分子直接或间接地与机体特定的生理、病理状态相关,反映了肺部或者全身其它部位疾病的信息。本研究利用超滤法将漏出性胸腔积液中的多肽组分进行分离,经脱盐富集后,进行纳升液相色谱-串联质谱分析。结果表明,在漏出性胸腔积液中共鉴定到来源于52种蛋白的314条多肽,超过一半的肽段来源于纤维蛋白原,并且许多肽段具有阶梯序列的特征。此外,在来源于胶原蛋白和纤维蛋白原的多肽中还发现了大量的脯氨酸氧化修饰。基因本体论富集分析显示,漏出性胸腔积液多肽组分所属蛋白均具有胞外分泌的属性。本研究给出了漏出性胸腔积液中多肽组的序列、等电点、分子量、翻译后修饰等理化参数的分布特征,为进一步寻找肺部疾病相关的多肽标志物提供了可借鉴的参考数据和分析方法。

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析麦氏弧菌蛋白质组

[目的]较系统地研究分析麦氏弧菌提取蛋白质。[方法]利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano-RPLC-MS/MS)法系统分析了来源于美国龙虾的一株麦氏弧菌F5-1提取总蛋白和总蛋白直接酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。纳升级反相液相色谱分析条件为:上样量为5μl,经C18预柱(200μm×0.5 mm,3μm,120)脱盐10 min,再经过Chrom XP C_(18)-CL毛细管柱(75μm×15 cm,3μm,120)分析,2%乙腈(0.1%甲酸)-98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脱90 min,采用ESI-Q-TOF MS,在IDA采集模式下分析鉴定麦氏弧菌提取总蛋白酶解产物。[结果]直接酶解鉴定到1 538种蛋白质,通过Gene Ontology分析了麦氏弧菌F5-1提取总蛋白的分子功能、生物进程和细胞组分。提取的麦氏弧菌蛋白具有催化、结合、结构分子、转录调节因子等功能活性,其中催化活性的蛋白比例较大,且多为参与代谢进程的相关酶类。[结论]研究可为麦氏弧菌蛋白质组学的深入研究奠定基础。

QuEChERS-超高效液相色谱-高分辨串联质谱技术检测鸡肉中6种抗球虫药物

建立了鸡肉中二硝托胺、尼卡巴嗪、地克珠利、妥曲珠利、莫能菌素及盐霉素6种抗球虫药物的超高效液相色谱-高分辨串联质谱多残留检测方法。经QuEChERS样品净化,首先使用含有1%（v/v）三氯乙酸的乙腈-水（3∶7,v/v）溶液提取样品中的被测物,再加入氯化钠,使用50 mg/mL N-丙基乙二胺（PSA）＋50 mg/mL中性氧化铝（Alumina-N）的混合分散固相萃取（dispersive solid phase extraction,DSPE）粉末净化提取,过0.22μm滤膜后以超高效液相色谱-高分辨串联质谱检测。选择Waters Acquity UPLCBEH C8色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm）,以甲醇-5 mmol/L醋酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱。使用正、负离子同时扫描模式,基质外标法定量。研究表明,6种目标化合物的线性范围为：二硝托胺,1.0~30.0μg/L;尼卡巴嗪,0.2~6.0μg/L;地克珠利、妥曲珠利,2.0~60.0μg/L;莫能菌素、盐霉素,4.0~120.0μg/L。空白样品中添加低、中、高3个水平的混合标准溶液,回收率在67.7%~126.8%之间,相对标准偏差（RSD）≤10.4%。6种抗球虫药物的定量限分别为：二硝托胺,2.50μg/kg;尼卡巴嗪,0.50μg/kg;地克珠利、妥曲珠利,5.00μg/kg;莫能菌素、盐霉素,20.00μg/kg。该方法操作简便,灵敏度高,且能够满足日常检测要求。

液相色谱-高分辨串联质谱法测定奶粉中A2β-酪蛋白及β-酪蛋白与乳清蛋白含量关系的研究

目的:建立奶粉中A2β-酪蛋白分离定量的液相色谱-高分辨串联质谱法,并利用婴儿配方奶粉中酪蛋白、乳清蛋白和总蛋白含量的关系,间接得到乳清蛋白含量。方法:样品经前处理后,采用ACQUITY UPLC HSS T_(3)柱(100 mm×2.1 mm×1.8μm),0.1%甲酸-水和乙腈为流动相,梯度洗脱分离。多反应离子监测模式定量测定其中的A2β-酪蛋白特征肽。结果:在0.02~2.0μmol/L范围内线性关系良好(r=0.9938)。在低、中、高三水平加标试验中,回收率在94.9%~98.7%,相对标准偏差在1.7%~3.7%,检出限为0.80 mg/100 g,可满足对奶粉中A2β-酪蛋白定量要求。采用该法对市售11批声称A2奶粉和18批未声称A2奶粉(以下简称A2奶粉和普通奶粉)中A2β-酪蛋白进行测定。结论:A2奶粉中A2β-酪蛋白占总β-酪蛋白含量的86.2%~98.7%,而普通奶粉则低至20.0%~50.0%。另外,乳清蛋白含量的间接测定值和理论计算值经统计分析,无明显差异(P>0.05),为分析婴儿配方奶粉中乳清蛋白含量是否符合国标要求提供参考。

超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法测定豆类中的硒代蛋氨酸

该研究利用超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC/ESI-Q-Orbitrap)技术,对硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱信息、分子离子质荷比和碎裂片段的质荷比进行采集,并对特征离子碎裂途径进行解析,建立了豆类中硒代蛋氨酸的检测方法。样品用三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液溶解后,涡旋混匀,超声提取,在恒温水浴条件下酶解,离心后取上清液过0.22μm滤膜后上机检测。采用Hypersil GOLD HILIC(50 mm×2.1 mm,1.9μm)色谱柱进行分离,以0.2%(体积分数,下同)甲酸6 mmol/L甲酸铵水溶液和0.2%甲酸6 mmol/L甲酸铵乙腈溶液为流动相梯度洗脱,采用电喷雾正离子模式电离,在全扫描/数据依赖扫描模式(Full MS/dd-MS2)下进行检测,基质匹配标准校正法定量。结果表明,硒代蛋氨酸的基质效应为15.75%,在0.05~0.5 mg/L范围内线性关系良好,相关系数(r^(2))为0.9976,方法检出限(LOD)为0.015 mg/kg,定量下限(LOQ)为0.05 mg/kg;空白样品在0.1、0.2、0.4 mg/kg 3个加标水平下的平均回收率为77.6%~83.2%,日内相对标准偏差(RSDr)为2.8%~4.8%,日间相对标准偏差(RSD_(R))为4.1%~6.5%。将方法应用于实际样品的检测,得富硒黑豆、富硒红豆、富硒绿豆中硒代蛋氨酸的含量分别为0.252、0.163、0.184 mg/kg。该方法具有前处理操作简单、结果准确、重复性好等优点,适用于豆类中硒代蛋氨酸的检测。

基于快速高分辨液相色谱串联质谱技术的代谢组学尿液分析方法的建立

采用快速高分辨液相色谱(RRLC)分离系统与QTRAP型及QTOF型MS/MS仪联用技术,通过考察尿液样本前处理方法,优化液相色谱条件和质谱检测参数,建立了用于尿液中代谢物分析的RRLC-MS方法。采用本方法对尿液浓度下的20种代表性代谢物进行了检测,考察了方法的灵敏度和精密度,证明本方法适用于尿液代谢组学的研究。对穿插在检测序列中的生物质控样本的监测结果表明,本方法的可重复性及获得的数据的可靠性良好。本方法已成功地应用于乳腺癌和宫颈癌的尿液代谢组学研究以及可能生物标志物的检测。

高分辨快速液相色谱-串联质谱法测定肉制品中的刚果红

建立了肉制品中刚果红的高分辨快速液相色谱-串联质谱(RRLC-MS/MS)测定方法。均质后的样品经乙腈与正己烷混合溶剂(1∶1)提取,乙腈提取层离心后直接上机测试。使用Agilent XDB C18色谱柱,以乙腈和10 mmol/L甲酸铵水溶液为流动相梯度洗脱,采用多反应监测方式(MRM)负离子模式检测,定量离子对与定性离子对分别为m/z 325.0/416.0与m/z 651.0/152.0,外标法定量。结果表明,刚果红在0.1～10mg/L范围内线性关系良好(r2>0.999),加标回收率为91%～102%,RSD为1.2%～4.0%,检出限与定量下限分别为0.07 mg/kg和0.18 mg/kg。该方法准确、高效,可用于肉制品中刚果红染料的快速检测。

超高效液相色谱-二极管阵列-串联四极杆静电轨道阱质谱法对杆菌肽组分的分析

开发建立了超高效液相色谱-二极管阵列-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用分析杆菌肽组分的方法。采用(Phenomenex C_(18)100 mm×3.0 mm,2.6μm)色谱柱,以0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇乙腈(75+25)溶液为流动相,0.3 mL/min线性梯度洗脱分离,紫外吸收波长为254 nm。采集杆菌肽各组分质谱母离子及其对应子离子,并进行解析,推测组分的结构。在所建立的条件下,检测出9个组分,杆菌肽各组分之间分离良好。利用紫外与质谱归一化法测定含量,两种结果相对偏差在0.01%~3.53%之间。建立的超高效液相色谱-二极管阵列-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱法能有效分析多肽类药物杆菌肽各组成成分,为杆菌肽的质量控制和工艺优化提供了参考。