疑似蛇毒液样品的纳升级超高效液相色谱-高分辨质谱分析鉴定

针对5个疑似蛇毒毒液及其沾染样品,基于纳升级超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(Nano LC-MS/HRMS)技术,结合尺寸排阻色谱分离,建立了一种蛋白质种类及物种归属的严格鉴定方法。5个样品经尺寸排阻色谱分离后均得到3个洗脱峰,分别冻干后以胰蛋白酶进行溶液内酶解处理并进行液相色谱-高分辨质谱分析鉴定。首先采用全扫描-数据依赖型MS/MS(Full MS/dd MS^(2))采集模式对样品中的肽段信息进行非靶向采集,依次与Swiss-Prot、蛇亚目(Serpentes)、游蛇科(Colubroidea)、眼镜蛇科(Elapidae)、眼镜蛇亚科(Elapinae)、眼镜蛇属(Naja)蛋白质数据库逐级收缩比对;再筛选符合肽谱匹配度、肽段错误发现率小于1%和特征肽段数目大于等于2的蛋白质,共鉴定到32种蛋白质均来自中华眼镜蛇(Naja atra),可归属于Naja atra的10个家族,主要为三指毒素、金属蛋白酶、磷脂酶A2等。最后,采用平行反应监测模式选取每种蛋白质的两条特征肽段进行靶向验证,当两条特征肽段均满足“至少75%的y^(+)和b^(+)离子的Δm/z小于5 ppm”时,方认为鉴定到了样品中的某一蛋白质。最终鉴定出5个样品均含有Naja atra蛇毒。此鉴定方法研究系统、严格,可为蛇毒中毒司法鉴定以及蛇毒药物研究等提供有效的技术支持。

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析蜈蚣提取蛋白质

结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳升级反相液相色谱-串联质谱(nanoRPLC-MS/MS)法系统分析了蜈蚣提取蛋白质胶内酶解和直接酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。建立的nanoLC分析条件为:上样8μL,经Chrom XP-C18毛细管柱(350μm×0.5 mm,3μm),2%乙腈(0.1%甲酸)-98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脱90 min;采用ESI-Q-TOF MS,并在IDA采集模式下分析鉴定蜈蚣提取蛋白质。胶内酶解鉴定到72种蛋白质,直接酶解鉴定到97种蛋白质,二者含26种相同的蛋白质。通过数据库比对,分析了蜈蚣提取蛋白质的生物进程、细胞组分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白质具有结合、酶催化、肌动等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大,且多为能量代谢进程中的相关酶类。

纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质

通过水提、酸沉法得到锦灯笼果实提取物,其中蛋白质含量为188 mg/g(以提取物干重计),共含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的31%。基于鸟枪法蛋白质组学的分析方法,用纳升级反相液相色谱-串联质谱(nano-RPLC-MS/MS)系统分析锦灯笼果实提取物中蛋白质的酶解产物,结合数据库检索,共鉴定得到60种蛋白质;通过生物信息学分析,得到锦灯笼提取物中的蛋白质具有催化活性、抗氧化活性、酶调节活性、养分贮液囊活性、运输活性、结合活性六大生物活性,其中鉴定到与抗氧化相关的蛋白质有3种,为锦灯笼中蛋白质的功能性质的进一步研究奠定了基础。

胃溃疡大鼠在合募配穴针刺后胃组织的纳升级二维液相色谱

目的:揭示合募配穴法治疗胃溃疡特异性效应和协同机制.方法:大鼠35只随机分为空白对照组、应激性胃溃疡模型组、募穴组(中脘穴)、下合穴组(足三里组)和合募配穴组(中脘穴配足三里穴组),利用水浸加捆绑法复制应激性胃溃疡模型大鼠,借助纳升级二维液相色谱(Nano-2D-LC)技术研究大鼠胃经下合穴及募穴针刺后胃组织差异蛋白表达谱峰.结果:在保留时间27和32min时,模型组、募穴组、下合穴组和合募配穴组比空白对照组多出色谱峰5个,并且色谱峰5个的峰面积依次对应缩小.结论:针刺对应激性胃溃疡的治疗机制可能与5种多肽含量的减小有关.

不同穴组针刺后哮喘大鼠肺蛋白质组的纳升级二维液相色谱分析

目的:利用纳升级多维液相色谱(Nano-2D-LC)技术,对照研究不同针灸穴组对哮喘的防治效应,为腧穴配伍及协同效应研究提供研究思路。方法:56只大鼠随机分为空白对照组、捆绑组、假手术组、哮喘模型组、三穴五针组、郄会配穴组、降气平喘组。模型组和各针刺组大鼠造模成功后,采用不同穴组针刺治疗并取肺组织,处理后利用Nano-2D-LC技术进行差异蛋白表达谱峰分析。结果:二维液相色谱显示:针刺组与模型组相比,有3种特异性多肽谱峰产生,提示这3种特异性谱峰的相关蛋白可能是针刺的相关蛋白。3个针刺组的共有峰面积相比较呈依次递增的趋势,降气平喘组共有峰面积最大,并且对于哮喘大鼠的平喘效应最强。结论:针刺对哮喘的治疗机制可能与针刺后的哮喘大鼠肺组织蛋白酶解液中的特异性蛋白表达有关。不同针刺穴组的协同效应有一定的差异。针刺体表穴位所产生的肺组织的特异性蛋白表达,揭示了经穴与相应脏腑具有特异性联系。

基于纳升级二维液相色谱技术的过敏性哮喘大鼠血清差异蛋白质谱表达

目的研究过敏性哮喘大鼠血清差异蛋白质谱表达。方法将24只Wistar大鼠随机分为空白对照组、捆绑组和哮喘模型组,应用纳升级二维液查色谱技术研究哮喘大鼠血清差异蛋白质谱表达。结果哮喘模型组血清多肽谱峰与捆绑组比较,新出现特异性峰1个,为13号峰(94.731 min);特异性消失的峰3个,为1号峰(77.489 min)、2号峰(78.418 min)和5号峰(80.533 min),可能与哮喘发病有关;捆绑组血清多肽谱峰与空白对照组比较,新出现特异性峰4个,为2号峰(78.418 min)、4号峰(79.398 min)、5号峰(80.533 min)和7号峰(81.824 min),特异性峰消失1个,可能与捆绑应激刺激有关。结论过敏性哮喘的发病机制与蛋白异常表达密切相关,但动物实验需要注意区分应激因素导致的相关蛋白表达干扰。

鼠肝蛋白质组的纳升级多维液相色谱分离

搭建了一个纳升级的二维液相色谱分离平台(nano 2D LC),该平台可以自动完成进样、除盐、分离及鉴定。以离子交换色谱(SCX)为第一维,反相液相色谱(RPLC)为第二维,对鼠肝组织的蛋白质组进行了研究。SCX采用阶梯式洗脱,RPLC运用线性梯度洗脱,以200nL/min的速度进行分离,峰容量可达620。

用于纳升级微量样品检测的原位激光诱导荧光系统

针对生命科学研究中测试样品量极少的关键问题,以毛细管作为样品检测池,采用入射光与荧光原位进出的系统设计方案;以半导体泵浦固体激光器作为激发光源、高分辨紧凑型光谱仪作为探测器,构建了用于纳升级微量样品检测的原位激光诱导荧光系统。利用水溶液中罗丹明B浓度的测量来验证系统性能。结果表明,罗丹明B浓度在93pg/mL～15ng/mL范围内与荧光强度有良好的线性关系,相关系数为0.9982,检出限为28pg/mL,证实该系统具有低噪声、低试剂消耗、低检出限、高灵敏度和精确度等优点,可满足生物测试的实际使用要求。

基于微流控技术的纳升级蛋白质结晶筛选方法的研究进展

X射线晶体学技术是目前蛋白质结构测定中最主要的方法。为了得到满足衍射要求的高质量蛋白质晶体,研究者通常耗费大量试剂和样品进行大规模结晶条件筛选。微流控技术通过对超微量流体的操纵,可大幅降低在蛋白质结晶筛选中蛋白样品的消耗。本文依据结晶方法,分别介绍了基于微批量法、蒸气扩散法、自由界面扩散法和透析法的微流控蛋白质结晶筛选方法的研究进展。

纳升级反相液相色谱串联质谱法分析海马蛋白质组

目的:为了全面了解海龙的蛋白质成分,对其蛋白表达谱进行蛋白质组学分析。方法:应用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取海马药材的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析,将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带切下进行胶内酶解处理后,应用纳升级反相液相色谱串联质谱(nano RPLC-MS/MS)法系统分析海马提取蛋白质胶内酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。结果:共鉴定到海马蛋白192种,等电点范围为4.06~12.18,相对分子质量范围为3.06×10~3~3.52×10~6,多肽10 680个;通过生物信息学方法分析了海马提取蛋白质的分子功能。得到海马提取物中的蛋白质具有结合、酶催化、肌动、ATP酶等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大。结论:本研究建立了海马的蛋白质表达谱,可为海马药材中蛋白质的深入研究奠定基础,对海马药材有效成分的分析和海马药材鉴别具有重要意义。

小麦叶片蛋白质组的2D-LC分离及Nano LC-MS/MS分析

【目的】二维液相色谱(2D-LC)与双向电泳(2-DE)技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MSBLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO);其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1551个组分,获得1867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。

反相毛细管整体柱的制备及其在多肽混合物分离中的应用

采用甲基丙烯酸月桂酯为基础功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,正十二醇、1,4-丁二醇及二甲基亚砜为致孔剂,在内径为75μm的石英毛细管内制备了具有良好机械性能及化学稳定性的反相毛细管整体柱。考察了致孔剂的种类、比例以及交联剂在单体混合物中的比例对柱压和分离效果的影响;以单体15%、交联剂15%、致孔剂70%(均为质量分数)作为优化配方,在70℃条件下反应24h;并对所合成的毛细管整体柱进行了电镜表征,测试了流速、柱长与柱压的关系。结果表明,毛细管整体柱的通透性良好,可通过延长柱长的方法提高分离效果。将所制备的毛细管整体柱装于纳升级高效液相色谱仪上进行牛血清白蛋白及血浆样本的胰蛋白酶酶切液的分离,获得了比较理想的分离效果。

反相高效液相色谱双梯度洗脱分离肽混合物及质谱分析

复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。"鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一。本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析。将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905。该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景。

亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质

建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明,第一维亲水作用色谱在碱性(pH 9.3)和第二维反相色谱在酸性(pH 3.3)的条件下,正交性最佳(R^2=0.34113)。在此基础上,结合馏分收集技术进一步评价了本测试系统在水稻叶片蛋白质分析中的正交性。结果表明,在所有馏分收集组分中,鉴定次数小于2次的水稻叶片肽段占总肽段数目的 50%以上,且一维液相色谱馏分收集的肽段在第二维色谱及质谱分离分析中,可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口,表明本研究建立的亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱结合馏分收集技术在复杂水稻叶片蛋白质分离鉴定中可提供良好的的分离正交性。结合水稻蛋白质数据库检索,共鉴定出207345个肽段,归属于2930个蛋白质簇。

大豆种子蛋白质组样品制备方法研究

以中黄13大豆成熟种子为材料,采用苯酚甲醇醋酸铵法、三氯乙酸丙酮法和尿素硫脲法进行了蛋白质初提与复提,并利用纳升级液相色谱串联质谱技术(Nano LC-MS/MS)分析比较了尿素硫脲法初提和尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提的样品,以及一维电泳预分离的尿素硫脲法初提样品,旨在构建能有效提高蛋白质提取率和鉴定率的样品制备方法。结果表明:尿素硫脲法初提结合苯酚甲醇醋酸铵法复提的蛋白得率最高,分别达到29.18%与4.08%;尿素硫脲法初提与尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提样品中共鉴定到2 246个蛋白质组,初提和复提样品之间差异十分明显;每次独立制备的尿素硫脲法初提样品平均可鉴定到1 167个蛋白质组,经一维电泳预分离后平均可鉴定到1 868个蛋白质组。研究表明,采用适当的蛋白质样品制备和预分离方法,能有效提高大豆种子蛋白质的提取率和鉴定率。

nanoUPLC Q-TOF MS/MS在大鼠肝移植蛋白质组学研究中潜在生物标记物的应用

建立应用纳升级超高效液相色谱-质谱(nanoUPLC Q-TOF MS/MS)联用技术研究大鼠同位肝移植术后不同时间差异表达蛋白质的蛋白质组学方法。建立10组大鼠肝移植动物模型后,随机分成术后3天组(n=5)和术后7天组(n=5)。分别于术后3天和7天处死5只受体,取肝组织,提取总蛋白,Trypsin酶解后,使用Waters公司独家专利MSeTM无标记定量技术,利用nanoUPLC-MS/MS技术对酶解后的肽段进行分析,数据库检索鉴定蛋白质,采用生物信息学工具对所鉴定的蛋白质进行功能分类。7天组与3天组相比,两样品中同时存在的大部分蛋白上调,其中10个蛋白点表达水平明显上调,比值变化在8.5倍以上。结合数据库搜索得到鉴定,这些明显上调的蛋白的分子功能主要与细胞骨架、离子结合、氧化应激反应、能量代谢等相关。

基于NANO-LC-MS/MS和生物信息学的抗特发性肺纤维化靶点的筛选与验证

目的利用生物信息技术检索特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)基因芯片数据,并结合体外实验,筛选与验证IPF相关的蛋白,为该疾病的药物开发提供潜在的作用靶点。方法采用基因表据库(Gene Expression Omnibus,GEO)检索“IPF”词条,下载GSE150910芯片数据,利用Bioconductor软件包DESeq2分析正常组和IPF组差异表达基因,对所获得差异基因进行基因本体论(gene ontology,GO)功能分析、日本京都基因与基因组百科全书(kyoto gene and genome encyclopedia,KEGG)通路分析、蛋白互作网络分析并作可视化处理。通过液质联用对差异基因对应的蛋白质进行定量;体外研究关键蛋白对α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)分泌或形成的影响。结果共筛选到69个与细胞外基质形成相关的差异表达基因,包括53个上调基因和16个下调基因;功能分析显示,差异基因主要涉及到细胞外基质的降解(degradation of the extracellular matrix)、胶原蛋白降解(collagen degradation)和胶原链三聚化(collagen chain trimerization)通路;蛋白互作网络分析和蛋白定量研究显示,与IPF相关的基因主要为金属蛋白酶(MMP-3,9,ADAMTS14)和P4HA3等;金属蛋白酶抑制剂和P4HA3抑制剂能抑制肺纤维α-SMA分泌。结论通过筛选差异表达基因,明确相关基因和蛋白在IPF发生或发展过程中作用,为IPF新药研发提供新思路和方案。