微囊藻毒素-LR的纳米均相时间分辨荧光免疫分析法

目的建立了微囊藻毒素-LR(MC-LR)的纳米均相时间分辨荧光免疫分析(nano-homogeneous time-resolvedfluoroimmunoassay,NHTRFIA)法。方法制备MC-LR抗原包被发光微粒[加入1 mg发光微粒、偶联MC-LR的牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)、人工抗原0.05 mg、0.4 mol/L氰基硼氢化钠溶液10μl,于37℃避光振荡反应48 h;加入0.3 mol/L的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液(pH=5.0)10μl,以封闭未结合位点,于37℃避光孵育1 h后离心];在微孔中加入上述发光微粒、MC-LR标准品或样品、生物素化抗MC-LR单克隆抗体各25μl,于37℃孵育30 min,然后加入175μl包被链亲和素的感光微粒于37℃孵育10 min,采用纳米均相时间分辨荧光检测仪进行检测。结果该方法所得回归方程为y=-1 812x2-6 075x+12 424(R2=0.997 6),检出限为0.02 ng/mL,批内RSD为5.8%～7.2%,批间RSD为9.5%～9.9%,平均回收率为85.0%～120.0%。结论该方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便、耗时短、测定范围宽、试剂寿命长的优点,尤其适合于生活饮用水中微量MC-LR的分析。

纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法的建立

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体,采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术(AlphaLISA)建立间接竞争DON定量检测方法。方法:DON-BSA包被发光微粒,生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂,优化检测条件并评价检测性能。结果:该方法的灵敏度为0.007ng/mL,检测范围为0.007～100ng/mL,批内批间变异系数均<5%。不同样品添加回收实验:玉米、小麦、啤酒回收率分别为84%～110%、67%～100%、74%～100%。结论:DON-AlphaLISA是目前DON检测中最灵敏的方法之一,该分析方法稳定性好,可测范围宽,具有很好的应用前景。

一种新型多元均相时间分辨荧光免疫分析方法的建立

制备出具有光学特异性的3种不同颜色量子点纳米微球和铽螯合物,分别与CEA、AFP和HBsAg的两株抗体偶联,采用双抗体夹心法模式,充分利用两株抗体与抗原的相互作用,通过采集不同量子点发出的荧光信号,根据其信号的强弱判定标记在量子点纳米微球上的抗体结合的抗原的量,从而实现多元待分析物的定性定量分析.结果表明,量子点的荧光信号与CEA、AFP和HBsAg抗原浓度呈线性关系,其函数分别为:lgY=2.791 73+0.915 84lgX(R=0.998 08)、lgY=3.695 43+0.456 44lgX(R=0.998 48)和lgY=4.128 98+0.409 45lgX(R=0.998 45),分析灵敏度分别为:0.44、0.24和0.02ng/mL.

多功能灵敏固相时间分辨荧光免疫分析仪设计

针对固相时间分辨荧光光谱的测量,设计出一种全新的固相时间分辨荧光免疫分析系统。使用氮分子激光器作为激发光源,采用积分球和单色仪相结合的荧光收集结构,使杂散光对样品荧光的影响降到最低;用光电倍增管进行光电转换,在500～700 nm范围实现了高分辨荧光光谱测量;利用数字方式实现取样积分功能,提高了系统的信噪比。系统可实现荧光寿命、时间分辨荧光光谱、物质浓度的自动测量,仪器的检测灵敏度可达10-12 mol/L,线性范围为10-12～10-9 mol/L,稳定性相对误差小于3%,荧光光谱分辨为0.5 nm。

基于固相抗体模式时间分辨荧光免疫分析测定雌三醇

采用二步标记法,借助二乙烯三胺五乙酸酐,将Eu3+标记到雌三醇完全抗原上,基于固相抗体竞争反应模式,建立了时间分辨荧光免疫分析测定雌三醇的新方法。在优化的条件下,方法的线性范围为0.005—1000ng·mL-1,检出限为4pg·mL-1。该方法用于检测血清中雌三醇的含量,结果令人满意。

固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂(Ⅰ)中间体—4,4′-二溴-6,6′-二甲基2,2′-联吡啶的合成

目的:合成固相时间分辨荧光免疫分析螯合剂的中间体-4,4′-二溴-6,6′二甲基2,2′-二吡啶。方法:根据自行设计的合成路线,以2-氨基6-甲基吡啶为原料,经重氮化、乌尔曼偶联合成6,6′-二甲基-2,2′-二吡啶,再经氧化、硝化、溴化、脱氧等合成4,4′-二溴-6,6′二甲基2,2′-二吡啶。结果:经元素分析、红外光谱,核磁共振波谱等方法证明:成功的合成了4,4′-二溴-6,6′二甲基2,2′-二吡啶。结论:通过自行设计路线完成了4,4′-二溴-6,6′二甲基2,2′-二吡啶的合成,为固相时间分辨荧光免疫分析的应用提供了有价值的中间体和制备方法。

一种均相时间分辨荧光免疫分析中间体、螯合剂及制备方法

摘要本发明提供了一种均相时间分辨荧光免疫分析中间体、螯合剂及制备方法,属于荧光免疫分析、有机合成技术领域.该结构利用含氮杂冠醚具有良好的水溶性,且能与联吡啶经过取代反应形成穴状化合物,所述的穴状结构的化合物既能吸收激发光并传递能量给Eu3＋,又能对Eu3＋有较强的螯合作用;既可增加螯合剂的稳定性和抗干扰性,又可提高螯合剂的水溶性;本发明还提供了一种时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法,螯合剂的激发光谱波长范围较宽为200~380nm,最大的激发光波长为363nm,有效地扩展了其激发范围,并且获得了在不同溶剂中的荧光光谱和荧光寿命.

均相时间分辨免疫分析铕穴状螯合剂的合成

以2,6-二(溴甲基)吡啶-3,5-二甲酸二乙酯为起始原料,经溴化、取代、加成及酸化反应合成了两种铕穴状荧光螯合剂Eu 3+ 2,6-{ N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸[Eu 3+ bpy.bpy.py(CO 2 H) 2 , 1 ]和Eu 3+ 2,6-{ N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二[ N -(2-氨基乙基)酰胺]{Eu 3+ bpy.bpy.py[CONH(CH 2 ) 2 NH 2 ] 2 , 2 },其结构和性能经 1 H NMR, MS(ESI)和荧光光谱表征。结果表明: 1 的最佳激发波长为312 nm,发射特征峰位于598和615 nm,荧光寿命为 1 064 μs,量子产量为10%。 2 的最佳激发波长为311 nm,发射特征峰位于597和616 nm,荧光寿命为398 μs,量子产率为12.1%。

均相时间分辨荧光免疫法检测降钙素原的性能评价

目的评价该科室新购置的赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪检测降钙素原(PCT)的性能。方法依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP系列文件及我国卫生行业检验相关文件等要求,评价赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪的精密度、准确度、正确度、稀释度、线性范围、干扰试验、携带污染率、参考区间等性能指标,并将其与雷度AQT90FLEX免疫分析仪进行比较。结果批内精密度的变异系数(CV)分别为0.51%、3.47%,批间精密度的CV分别为1.66%、5.14%,均<±7.5%[1/4系统总误差(TEa)];正确度:使用的参考物质水平均落在正确度验证区间内;准确度:2021年4月份上报的5份标本室间质评结果回报均通过国家临床检验中心室间质评标准,成绩为100%;稀释度偏倚在1∶50倍稀释时为±7.2%,1∶100倍稀释时为±7.4%,均<±10%(1/3 TEa);线性范围:0.02~50μg/L;常见潜在的内源性干扰物对PCT检测无明显影响(干扰均<±10%);携带污染率为0.03%,不会产生假阳性结果;参考区间:P_(95)为0.064μg/L;其与雷度AQT90FLEX免疫分析仪进行比较有良好的相关性(R^(2)=0.995),在医学决定水平0.5μg/L和2.0μg/L时相对偏差分别为8.83%和7.95%,均<±10%(CLIA88/2)。结论赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪各参数性能验证均符合要求,其良好的稀释度性能可为临床提供更高水平的检测数据,与雷度AQT90 FLEX免疫分析仪具有良好的相关性,可以投入临床实验室使用。

时间分辨荧光免疫分析的新进展

对2003~2015年间时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)的新进展作了综述,包括荧光共振能量转移TRFIA、酶放大TRFIA和基于纳米颗粒的TRFIA,以及时间分辨荧光免疫分析与流动注射分析、实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)等技术联用的应用情况,并对TRFIA的发展前景进行了展望(引用文献82篇)。

基于纳米金多光子激发荧光的均相免疫检测新方法

本文报道了粒径小于20nm的球形纳米金颗粒(AuNSs)的强多光子激发荧光,这主要归因于多光子激发过程中的高光子密度引起的局域场增强效应。AuNSs的多光子荧光与影响局域场增强效应的颗粒尺寸及团聚程度有关。基于吸附在纳米金表面的BSA与Anti-BSA的作用引起纳米金团聚导致其多光子荧光增强,结合近红外区的多光子激发可以避免生物分子自发荧光及散射光的干扰这一优势,建立了一种高灵敏、高选择性检测血清中Anti-BSA的均相免疫分析方法。检测的线性范围从1.16nmol/L到35nmol/L,检出限为0.08nmol/L。而且通过在纳米金颗粒表面包覆硅壳实现了纳米金的荧光增强及表面功能化,由此可以建立一系列基于纳米金多光子荧光的分析检测方法。

均相时间分辨荧光法测定阿达木单抗结合活性

目的建立一种基于均相时间分辨荧光(HTRF)技术的分析方法,用于快速、简便、稳定地检测阿达木单抗与TNF-α抗原的结合活性。方法将检测试剂、梯度稀释的标准品及待测样品加入96孔板,孵育后在酶标仪上读取荧光信号值,用软件对信号值和抗体浓度进行四参数曲线拟合,根据标准品及待测样品的EC_(50)值计算样品的相对结合活性;同时对方法的专属性、准确性、精密度、线性与范围及稳定性指示能力进行验证;此外对该方法与常规酶联免疫吸附法(ELISA)进行了对比研究。结果建立的HTRF检测法呈典型的“S”型剂量-效应曲线;方法验证结果显示,本法专属性强,相对结合活性的检测范围为50%~150%,在此范围内线性良好,相关系数在0.99以上,斜率接近1.0;平均回收率范围为92.5%~104.8%;重复性及不同人员之间精密度的CV均不超过15%;本法可反映加热破坏的单抗样品的结合活性变化趋势;对比研究显示,HTRF法与ELISA法测得的结果等效。结论建立了一种新的检测阿达木单抗与TNF-α结合活性的测定方法,该法经验证符合要求,可代替ELISA法用于该类单抗药物结合活性的测定,适用于细胞克隆筛选、原液或成品质量放行检测及稳定性研究等。

比较三种免疫分析法检测微囊藻毒素-LR

目的评估微囊藻毒素-LR(MC-LR)的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)、纳米均相时间分辨荧光免疫分析(NH-TRFIA)和酶联免疫分析(ELISA)三种免疫检测方法。方法通过比较包被板、反应步骤、信号系统和试剂用量,分析反应条件的差异;通过分析灵敏度、精密度和准确性,比较上述方法的性能指标;通过检测实际样品,评估方法的可靠性。结果 NH-TRFIA反应时间最短,试剂消耗量最少,灵敏度最高,量程宽;TRFIA信号最强,稳定性佳;三种方法精密度高,相对标准差均小于15%。三种方法检测实际样品与高效液相色谱法的分析结果差异无统计学意义,认为可靠。结论 TRFIA和NH-TRFIA,技术优势明显,应用前景广阔。

基于纳米铕核铁蛋白时间分辨荧光免疫方法的建立

以人铁蛋白(ferritin,FER)为材料,制备纳米铕核微粒,并建立竞争型FER免疫检测方法。用稀盐酸解离FER的亚基后,纯化脱去游离铁,再通过酸碱中和方法重组蛋白外壳,同时将铕离子包裹于去铁蛋白内,制备铕核铁蛋白。经反应条件优化,确定pH 2.0为FER最适解离酸度。FER外壳重组时,铕试剂的添加量约为FER物质量的10 000倍时能获得最大捕获效率。以此建立了铕核-FER时间分辨荧光免疫检测方法,其灵敏度为0.576ng/mL,IC_(50)为13.15ng/mL,批间变异系数CV%<15%,非特异性结合率低。用制备成的铕核-FER构建的竞争法TRFIA与FER夹心法试剂盒对照,两者相关系数达0.966。通过上述方法获得免疫活性好、铕含量高的标记用纳米分子,简化了传统的铕标记方法,建立了构建纳米铕核铁蛋白的新方法。

稀土穴状荧光配合物的合成与光谱性质

以2,6-二甲基吡啶-3,5-二甲酸二乙酯为起始原料,经N-溴代丁二酰亚胺(NBS)溴代、亲电取代反应合成了时间分辨荧光免疫分析双功能螯合剂2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-3,5-二羧酸二乙酯。经差热分析仪(DTA)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、核磁共振波谱仪(1 H NMR)、质谱仪(MS)等技术手段表征确认了化合物结构和性能。对该化合物与铕离子形成螯合物的荧光性质研究表明:激发光谱波长范围较宽,激发峰值为322nm;荧光发射峰为597nm(~5D_0-~7F_1)、618nm(~5D_0-~7F_2);荧光寿命为918μs;量子产率Φ=0.249。

环索奈德通过靶向HIV-1衣壳蛋白六聚体调节其体外装配

多肽CAI在HIV-1衣壳蛋白(CA)C末端的结合口袋可用来筛选CA蛋白装配调节剂。采用均相时间分辨荧光技术(HTRF)筛选399个化合物,发现1个小分子化合物环索奈德(ciclesonide)能够竞争性抑制十二肽CAI与CA蛋白C末端的结合,其半数抑制浓度IC_(50)值为6.06μmol/L。生物膜干涉技术(BLI)测量环索奈德与CA蛋白(单体和六聚体)的结合,环索奈德与CA六聚体的亲和力为159 nmol/L,远远大于其与CA单体的亲和力(K_(D)=1.68 mmol/L)。衣壳蛋白体外装配实验表明,环索奈德能促进CA蛋白的装配,且具有浓度依赖性。分子模拟分析环索奈德与CA蛋白的结合模式,显示环索奈德与CA六聚体的相互作用发生在六聚体相邻亚基N末端-C末端的界面上,并与H67和L211两个残基形成氢键。研究表明,环索奈德是一种潜在的HIV-1衣壳装配调节剂。

小鼠肿瘤坏死因子ELISA、TRFIA及ALPHAScreen检测方法的建立及评估

目的分别建立ELISA、TRFIA及ALPHAScreen检测小鼠肿瘤坏死因子(mTNF-α)的方法,对3种检测技术进行评估。方法采用两株针对mTNF-α不同表位的单克隆抗体,分别构建双抗体夹心法mTNF-α-ELISA、mTNF-α-TRFIA、mT-NF-α-ALPHAScreen,对以上3种检测方法进行反应动力学,方法学参数和相关性的比较。结果 ALPHAScreen采用均相反应系统,反应速度最快。TRFIA和ALPHAScreen由于采用了稀土离子作为标记物,其灵敏度和检测范围大大高于ELISA。样品检测结果表明,3种方法的相关性较好。结论本文建立的mTNF-α-TRFIA和mTNF-α-ALPHAScreen具有很好的应用前景。

AlphaLISA技术在食品安全检测中的研究进展

纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)是一种基于纳米微珠的光激化学发光的新型均相检测技术,较传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)具有均相、免清洗、敏感度高、特异性强等特点。本文介绍了AlphaLISA的原理和特点,简要总结了近年来国内外AlphaLISA技术的应用研究,重点综述了食品安全领域(包括生物毒素和药物残留)的研究进展,并对此技术的发展前景进行了展望。

盐酸克伦特罗的AlphaLISA检测方法的建立

目的：采用纳米均相时间分辨荧光免疫技术(amplified luminescent proximity homogeneous assay, Alpha-LISA)建立高灵敏检测盐酸克伦特罗(clenbuterol, CLB)残留的方法。方法在发光微粒上固定 CLB,与游离的CLB共同竞争固定在感光微粒上的CLB单克隆抗体,优化检测条件并进行方法学考核。结果该方法的灵敏度为0.04 ng/mL。猪肉样品回收率在83%~109%之间,牛肉样品回收率在92%~112%之间；猪肉样品检测的批内变异系数CV<10%、批间变异系数CV<15%。与特布他林、沙丁胺醇的交叉反应率分别为34.5%、25.7%,与莱克多巴胺、妥布特罗、齐帕特罗无交叉反应。结论 CLB-AlphaLISA 检测肉类中克伦特罗残留具有简单、快速、灵敏性高、特异性强、稳定等特点,具有广阔的应用前景。

4,4＇-二溴-6,6＇-二(N,N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2,2＇-联吡啶的合成与表征

以4,4'-二硝基-6,6'-二甲基-2,2'-联吡啶-N,N'-二氧化物为起始原料,经过三氟乙酸酐酯化、羟甲基化、氢溴酸溴甲基化及亚氨基二乙酸二乙酯氢胺基甲基化合成了4,4'-二溴-6,6'-二(N,N-二(乙氧基羰甲基)氨甲基)-2,2'-联吡啶。通过熔点、红外光谱、核磁共振、高效液相色谱、高分辨质谱测试技术表征了该化合物的结构,为合成时间分辨荧光免疫分析新型双功能螯合剂提供了重要中间体。