纳米花型酶-无机杂化固定化酶研究进展

酶是一种绿色高效的生物催化剂,被广泛应用于工业生产中,为了更好地提升游离酶的性能,酶固定化技术应运而生。然而,与游离酶相比,固定化酶活性下降以及传质受限一直是酶固定化技术亟待解决的关键问题。作为一种新型酶固定化技术,纳米花型酶-无机杂化固定化酶因具有高比表面积、高酶活性和高催化效率且制备过程简单、绿色无污染而受到广泛关注。本文综述了近年来纳米花型酶-无机杂化固定化酶的研究进展,根据纳米花型酶-无机杂化固定化酶的形成特点,将其分为单酶纳米花、双酶纳米花和负载型纳米花。阐述了纳米花型酶-无机杂化固定化酶的制备过程和形成机理,并对纳米花型酶-无机杂化固定化酶在食品工业和检测领域的应用进展进行总结。最后,对纳米花型酶-无机杂化固定化酶的发展前景作出展望。

生姜蛋白酶无机大分子杂化纳米花的制备与研究

为提高游离生姜蛋白酶的酶活力,文章利用生姜蛋白酶和无机金属盐离子通过组装的方法成功合成了一种具有多级花状结构的新型纳米材料。通过扫描电子显微镜确定了生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的组成和结构,并进一步优化了生姜蛋白酶无机大分子杂化纳米花的制备条件,研究了其酶学性质和使用稳定性,初步探索了纳米花酶活力与其形貌结构的关系。实验结果表明,以生姜蛋白酶为有机成分,磷酸铜为无机成分,制备的酶-无机杂化纳米花的形貌结构与酶浓度、Cu^(2+)浓度、pH、温度等因素密切相关,纳米花外表圆润、花瓣饱满、形状规整、粒径相似时,生姜蛋白酶-无机杂化纳米花的酶活也更高。当酶浓度为0.5 mg/mL、CuSO_(4)浓度为0.8 mol/L、pH为6.0、温度为4℃时,酶活力最高,可达到10302.2 U/mg,是游离生姜蛋白酶的7000%,温度、酸碱稳定性较高,重复使用性较好。

蛋黄-壳结构Fe_3O_4@SiO_2@PMO磁性微球的制备及对漆酶的固定化

以蛋黄-壳结构的Fe3O4@SiO_2@PMO磁性微球作为载体,采用交联法对漆酶进行固定,考察了戊二醛浓度等对固定效果的影响,并对固定后漆酶的活性进行了研究.结果表明,蛋黄-壳结构的磁性微球负载漆酶仅需6 h,磁性微球对漆酶的固载量高达475 mg/g.固定后漆酶的稳定性显著提高,在pH=2. 5～4. 5的强酸性条件下,固定后漆酶酶活仍可保持70%以上,即使温度升高至60℃,固定后漆酶的相对酶活仍保持65%以上.这说明漆酶经所合成的材料固定后,其耐酸和耐热能力都明显优于游离漆酶.包覆的Fe_3O_4粒子使得材料很容易经磁铁分离法回收,固定后漆酶经磁分离循环使用10次后仍然能保留85%的酶活,具有良好的可操作性和稳定性,有效降低了漆酶的使用成本.

基于杂化材料和碳纳米管的硝酸还原酶电极

介绍了一种基于有机-无机杂化材料和碳纳米管的硝酸还原酶电极的制备方法.杂化材料由巯基乙酸接枝聚乙烯醇和二氧化硅溶胶组成,碳纳米管和硝酸还原酶同时包埋在杂化材料中,利用甲基紫精为电子媒介,制得新型的安培型硝酸还原酶电极.此酶电极可以在-0.70.V(vs SCE)下对硝酸根进行测定,碳纳米管的加入使响应电流增大了1倍左右.酶电极的线性范围为0.01～0.5.mmol/L,检测限为1.13×10-6.mol/L.平均响应时间为6.8 s左右.

过氧化氢酶-无机杂化纳米花的制备及催化特性

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一种在食品、医疗、纺织等领域广泛应用的工业酶,具有催化效率高、专一性强、绿色环保等突出特点。工业中游离过氧化氢酶无法回收再利用,导致以其为核心的工业生物转化过程成本较高。开发一种简单、温和、低成本并且体现绿色化学理念的方法对过氧化氢酶进行固定化有望提高其利用率并且强化酶学性能,具有迫切的现实需求。本研究将源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的过氧化氢酶KatA在大肠杆菌中进行重组表达,之后将分离纯化得到的纯酶以酶-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶并进行酶学性质研究。结果显示,利用乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析3步纯化,最终获得电泳纯的重组KatA,之后通过优化制备条件获得了一种新型KatA/Ca_(3)(PO_(4))_(2)杂化纳米花固定化酶。酶学性质研究结果显示,游离酶KatA的最适反应温度为35℃,KatA/Ca_(3)(PO_(4))_(2)杂化纳米花的最适反应温度为30-35℃,二者最适反应pH值均为11.0。游离酶KatA和KatA/Ca_(3)(PO_(4))_(2)杂化纳米花在pH 4.0-11.0和25-50℃条件下均表现出较好的稳定性。KatA/Ca_(3)(PO_(4))_(2)杂化纳米花显示出比游离酶KatA更好的储存稳定性,在4℃储存14 d后仍保留82%的酶活力,而游离酶仅具有50%的酶活力。此外,纳米花在进行5次催化反应后仍具有55%的酶活力,表明其具有较好的操作稳定性。动力学研究结果显示,游离酶KatA对底物过氧化氢的K_(m)为(8.80±0.42)mmol/L,K_(cat)/K_(m)为(13151.53±299.19)L/(mmol·s);而KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花的K_(m)为(32.75±2.96)mmol/L,K_(cat)/K_(m)为(4550.67±107.51)L/(mmol·s)。与游离酶KatA相比,KatA/Ca_(3)(PO_(4))_(2)杂化纳米花对底物过氧化氢的亲和力下降,同时其催化效率也有所降低。综上所述,本研究以Ca^(2+)作为自组装诱导剂,成功将KatA以酶-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶,不仅对部分酶学性能实现了强化,而且为固定化过氧化氢酶的绿色制备和规模化应用奠定了基础。

基于环氧功能基团的杂化硅胶固定化酶反应器

在蛋白质组学研究中,为解决自由溶液酶解时间长、蛋白酶自降解等问题,各种类型的固定化酶反应器引起了人们的关注.采用溶胶凝胶法,在100μm内径毛细管内,以3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷为功能单体,以四乙氧基硅烷为交联剂,制备了一种新型的杂化硅胶整体材料.并通过在整体柱表面由环氧功能团水解得到的二醇与胰蛋白酶(trypsin)的氨基进行一步反应,实现了胰蛋白酶固定化.利用该IMER,在47s内实现了牛血清白蛋白的酶解;经反相色谱分离和质谱鉴定,序列覆盖率在35%以上,与自由溶液酶解12h的效果相当.结果表明,基于亲水性杂化硅胶整体材料的IMER有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用.

人神经母细胞瘤的磷酸化膜蛋白质组分析

针对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系的磷酸化膜蛋白质组,发展了基于多酶酶解法结合杂化硅胶基质固定化钛离子亲和色谱(Ti 4+-IMAC)整体柱富集的分析策略。该方法通过对细胞裂解液进行超速离心,以及1 mol/LNaCl和0.1 mol/L Na2CO3顺序清洗,获得膜蛋白质组分。所提取的蛋白质分别经胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶平行酶解,产生的肽段经Ti 4+-IMAC整体柱选择性富集磷酸肽后,采用纳升级反相液相色谱分离和质谱鉴定,成功鉴定到43个磷酸化蛋白质,其中有14个定位于膜上。研究结果表明,采用该策略开展SH-SY5Y细胞系磷酸化膜蛋白质组学分析有望加速对该肿瘤的研究和相关潜在标记物的筛选。