牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒双重纳米RT-PCR检测方法的建立及应用

本文建立了一种同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)2种病原的双重纳米RT-PCR方法。采用BVDV 5′-UTR基因序列(GenBank登录号:AB040132.1)和BCoV的N基因保守序列(GenBank登录号:KX982264.1)设计出一对BVDV特异性引物和一对BCoV的特异性引物,结果表明此方法对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛轮状病毒(BRV)均无交叉反应,特异性良好。同时,应用此方法检测33份腹泻牛的临床样品和25份腹泻鹿的临床样品,结果得出BVDV、BCoV和2种病原混合感染的牛样品阳性率分别为15.15%、36.36%和6.06%。鹿样品感染BVDV、BCoV和2种病原混合感染的阳性率分别为28%、8%和8%。此外,敏感性试验结果为常规RT-PCR敏感性的10倍,最低检出限为1 fg。研究表明,本文建立的该方法快速、灵敏、简捷,具有较强的特异性、敏感性,可适用于大批量临床样品检测,为反刍动物相关病毒性腹泻的诊断和防控提供一定技术支撑。

鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株双重纳米RT-PCR检测方法的建立和应用

为了建立快速高效鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典株与变异株的检测方法,本研究参照GenBank中PEDV经典株CV777和变异株CH-HB1-2018的S基因序列,设计了3条特异性引物,并以纳米金颗粒作为热导介子,通过优化PCR反应条件,建立了能够区分PEDV经典株和变异株的双重纳米RT-PCR检测方法。利用该方法同时检测PEDV经典株和变异株、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),结果显示,该方法能特异性鉴别PEDV经典株(747 bp)和变异株(442 bp),且与其他病原均无交叉反应,特异性较强;将重组质粒标准品10倍倍比稀释后分别利用该方法和普通RT-PCR同时检测,结果显示,本研究建立的双重纳米RT-PCR方法能检测出经典株CV777和变异株CH-HB1-2018重组质粒标准品的下限分别为5.68×10^(2)拷贝/μL和4.93×10^(2)拷贝/μL,其敏感性较普通RTPCR的敏感性高100倍。利用本研究建立的方法对不同地区采集的阳性病料提取基因组后分别于同一时间和不同时间进行检测,结果显示该方法稳定性和重复性良好。利用该双重纳米RT-PCR方法对34份采集自河北省腹泻仔猪的样品进行检测,结果显示与普通RT-PCR检测结果符合率为97.1%,且PEDV变异株的阳性率高于PEDV经典株。本研究建立的双重纳米RT-PCR方法为PEDV病原鉴别检测及流行病学调查提供了可行的技术手段。