纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因 ,与质粒PBV2 2 0连接 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α .挑取阳性克隆用EcoRⅠ /BamHⅠ双酶切鉴定得到一条约10 0 0bp的条带 .阳性克隆经温度诱导表达 ,用SDS_PAGE电泳鉴定 ,在 38kD处有一条明显的带 ,占菌体蛋白的 2 0 %左右 ,同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在 .包涵体经收集。

纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 构建纳豆激酶原基因克隆 ,实现其在大肠杆菌中的表达。方法 从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA ,作为模板通过PCR扩增纳豆激酶原基因。运用重组DNA技术 ,构建表达质粒pESX 1,转化大肠杆菌JF112 5 ,温度诱导表达目的蛋白。结果 琼脂糖凝胶电脉及核苷酸序列分析证实 pESX 1为含纳豆激酶原基因的阳性克隆。在大肠杆菌中表达纳豆激酶原 ,经自体加工产生具有纤溶活性的纳豆激酶。结论 成功地构建了纳豆激酶原基因克隆 ,实现了在大肠杆菌中的表达。

前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究

纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,该酶具有强烈溶栓活性。本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α,测序结果表明,所克隆片段全长1152bp,与GenBank中已报道序列同源性达100%。将目的基因片段与表达载体pBV220连接,构建重组表达质粒pBNK,转化大肠杆菌HB101。采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42℃和44℃)诱导表达,结果发现转化菌pBNK6-HB101在LB培养基中经30℃培养,42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的25.35%,转化菌pBNK6-HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养,无明显差异。

前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体的构建及鉴定

目的克隆前纳豆激酶原基因,实现其在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究。方法从枯草芽孢杆菌中分离纯化基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α;将目的基因片段与表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒pENK,转化大肠杆菌BL21(DE3),对其表达条件进行研究。结果序列检测结果表明,所克隆片段全长1152bp,与Genbank中已报道序列相比较,同源性达到100%。转化菌pENK108-BL21(DE3)经IPTG诱导表达目的产物,SDS-PAGE检测结果显示具特异条带,Western Blotting检测结果表明,表达产物确系目的融合蛋白。转化菌pENK108-BL21(DE3)在LB培养基中经37℃培养,1mmol/L IPTG诱导4h后,目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的31%。时间凝块法显示表达物具有一定的纤溶作用。结论成功构建前纳豆激酶原基因化学诱导型表达载体,并对转化菌的表达条件进行了研究。