敲低TPX2对猪卵母细胞纺锤体组装及凋亡的影响

[目的]本研究旨在探究Xklp2靶蛋白(TPX2)在猪卵母细胞减数分裂过程中的表达定位及其潜在功能。[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(COC)并随机分组后进行体外成熟培养,通过间接免疫荧光染色与蛋白免疫印迹等方法检测TPX2在卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位与动态表达情况;通过生发泡期(germinal vesicle, GV)显微注射特异性siRNA以敲低TPX2,研究其对卵母细胞减数分裂进程、纺锤体结构以及早期凋亡的影响。[结果]TPX2在第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)表达量显著上升,其亚细胞定位与α-微管蛋白(α-tubulin)的分布特点相似,并主要富集在纺锤体两极。TPX2被敲低后卵母细胞第一极体(PB1)排出率显著下降(P<0.05),且大多数细胞被阻滞在生发泡破裂期(GVBD)和第一次减数分裂后末期(ATⅠ),同时纺锤体结构异常比例显著升高(P<0.05),并伴随染色体排列紊乱。与对照组相比,敲低TPX2后卵母细胞早期凋亡率急剧增加(P<0.05),凋亡相关基因Caspase 3表达量以及Bax/Bcl2值显著升高(P<0.05)。[结论]TPX2与猪卵母细胞减数分裂过程中的纺锤体组装及细胞周期调控密切相关,敲低TPX2引起卵母细胞纺锤体结构异常,并诱导早期细胞凋亡,最终导致卵母细胞成熟失败。

纺锤体组装检查点在肺癌中的研究进展

纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)是细胞正确进行有丝分裂(mitosis)的一种保护机制,以防止有丝分裂中后期染色体动粒(kinetochore)存在未附着或不正确附着微管的情况下继续有丝分裂,从而避免整条染色体的增加或丢失而产生非整倍体(aneuploidy)细胞。非整倍体以及SAC组成蛋白的表达改变是不同癌症种类,包括肺癌的共同特征之一。因此,SAC是一种潜在的肺癌治疗新靶点。目前,SAC上游组分蛋白单极纺锤体蛋白激酶1(monopolar spindle 1,MPS1)小分子抑制剂已有5种进入临床试验。本文介绍了SAC的生物学功能,总结了SAC组分蛋白在多种癌症中的表达异常和MPS1抑制剂的研究进展,期望对未来开发靶向SAC组分的肺癌治疗策略提供参考。

癌症高表达蛋白——Hec1在纺锤体组装检查点中的作用

细胞增殖依赖于细胞分裂前染色体的复制及随后的姐妹染色单体分离到达两极。纺锤体组装检查点具有确保染色体信息传递保真性的作用,检查点的缺失可能导致染色体的分离异常和肿瘤形成。癌症高表达蛋白(Hec1)通过与调控G2/M期的蛋白间的相互作用而在染色体的分离中发挥重要作用。Hec1与Nuf2的复合物,在G2/M期与动粒相结合,Hec1的缺失将导致严重的染色体分离错误。Hec1具有召集Mps1和Mad1/Mad2复合物结合到动粒上的作用,这种结合可以激活纺锤体组装检查点途径中非常重要的APCCdc20途径。但是Hec1、Mps1、Mad1三者之间的相互作用仍未明了。Hec1还可以通过与26S蛋白酶复合物的不同亚基结合调控其功能。Hec1是一种丝氨酸磷酸化蛋白,其磷酸化是由Nek2在G2/M期完成的。

纺锤体组装关卡基因hsMAD2在人肝细胞肝癌中的表达及其意义

目的:探讨人原发性肝细胞肝癌中纺锤体组装关卡hsMAD2蛋白的表达及其意义。方法:采用免疫组织化学 SABC法检测了hsMAD2在39例HCC组织、26例肝硬化组织和3例HCC细胞系的表达情况,并分析了其阳性率与HCC病理分级的关系。结果:59％(23/39)的HCC组织表达hsMAD2,而癌旁肝组织的阳性率为100％(15/15);肝硬化为92％(24/26),3例HCC细胞系均未见表达.hsMAD2在HCC中表达率与HCC 病理分级无关,而在癌组织与癌旁肝组织(x^2=6.888,P<0.01)、肝硬化组织(x^2=8.656,P<0.01)之间的差异具有显著性。结论:hsMAD2在HCC组织中的表达率相对于癌旁肝组织和肝硬化组织显著降低,提示该蛋白的表达可能与早期HCC发生相关。

纺锤体组装检验点

在细胞分裂过程中,纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint,SAC)监控着染色体与纺锤体微管的结合以及有丝分裂中姐妹染色单体或减数分裂同源染色体间的张力,从而保证染色体正确均等地分配到两个子细胞中。SAC功能异常可能导致非整倍体产生,后者与肿瘤的形成以及自发流产和先天出生缺陷等疾病有密切的关系。

纺锤体组装检控点

细胞有丝分裂过程中,纺锤体组装检控点监控着染色体在赤道板的队列和向纺锤体两极的分离,确保动粒-微管的黏附和有丝分裂器的完整,使所有的染色体都置于赤道板并双极定向后才进入后期,保证遗传物质均等地分配给两个子代细胞。纺锤体组装检控点缺陷将导致非整倍体的出现,并与一些肿瘤的发生密切相关。现就近年来纺锤体组装检控点蛋白以及纺锤体组装检控点功能缺陷与肿瘤的关系方面的研究进展作一简要综述。

骨肉瘤细胞中KDM5C与有丝分裂期纺锤体组装检查点关系的研究

目的:探讨赖氨酸特异性去甲基化酶5C(lysine-specific demethylase 5C,KDM5C)在骨肉瘤细胞有丝分裂期的变化及其对有丝分裂期纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的调控。方法:利用细胞周期同步化方法,收集不同骨肉瘤细胞系有丝分裂期各时间节点的细胞样品,利用Western blot检测各时间点KDM5C蛋白质含量的变化及其翻译后修饰与有丝分裂期进程的关系;并用特异性抑制剂CPI-455抑制KDM5C的去甲基化转移酶活性,利用Western blot检测有丝分裂期进程中抑制KDM5C的去甲基化酶活性对SAC相关标志蛋白细胞分裂周期蛋白-27(cell division cycle protein 27,cdc27)、周期蛋白B1(Cyclin B1)的影响。结果:在有丝分裂进程中,与SAC相关的标志蛋白cdc27的磷酸化滞后条带的位移变化和Cyclin B1的蛋白降解均与文献报道相似,但KDM5C蛋白含量无明显变化;KDM5C截短体表达未观察到明显的位移减慢或泛素化降解条带;抑制其去甲基化酶活性后,相较对照组,标志蛋白cdc27的去磷酸化曲线和Cyclin B1降解曲线未见明显变化。结论:在骨肉瘤细胞系有丝分裂期中,KDM5C的蛋白质含量不随有丝分裂期进程而改变,抑制其去甲基化酶活性不影响对SAC的灭活。

叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡及纺锤体组装检查点相关蛋白表达的影响

目的:探讨叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡以及纺锤体组装检查点相关蛋白基因表达的影响及其机制。方法:用不同浓度的叶酸(200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L)培养L02细胞2周后,用倒置显微镜观察L02细胞形态;流式细胞术检测细胞周期与凋亡;CCK8测定细胞增殖情况;qRT-PCR检测Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达;Western blotting检测相关蛋白Mad2、Bub1、BubR1的表达。结果:与正常对照组相比,叶酸缺乏使L02细胞出现细胞体积变大、形态不规则现象;叶酸缺乏可降低L02细胞活性(P<0.01),诱导细胞发生S期阻滞(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05),上调Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平(P<0.01)。结论:在L02细胞培养中,叶酸浓度为200 nmol/L时导致叶酸缺乏,SAC功能受损,细胞增殖异常,严重缺乏时导致细胞发生凋亡。

上海科学家与美国科学家合作揭秘纺锤体组装机理

据2009年2月11日《上海科技报》消息，中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞研究所朱学良研究员与美国华盛顿卡耐基研究所郑诣先教授的一项合作研究揭示：与细胞运动相关的Nudel蛋白和素有“分子马达”之称的胞质动力蛋白，在纺锤体基质组装中发挥重要作用，并能调节纺锤体的正确形成。该成果已在2月9日《自然·细胞生物学》杂志在线发表。

有丝分裂纺锤体组装检查点基因在肿瘤发生发展中的研究进展

有丝分裂纺锤体组装检查点主要负责维持染色体的正常分离,确保基因组的稳定性。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(budding uninhibited by benzimidazoles-1,BUB1)、有丝分裂阻滞缺陷蛋白-2(mitotic arrest deficient-2,MAD2)及细胞分裂周期蛋白(cell division cycle 20,CDC20)是有丝分裂中重要的调控基因,,并与肿瘤的发生发展、侵袭、转移、耐药及预后不良等密切相关。本研究对BUB1、MAD2和CDC20在恶性肿瘤发生发展中的作用进行综述,以期为肿瘤靶向治疗提供新的依据。

胃癌中PCMT1表达的预后价值及其对纺锤体组装检查点的调控作用

目的 探讨蛋白质-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)-甲基转移酶(PCMT1)在胃癌中的表达及对预后的影响,并分析其潜在的作用机制。方法 UALCAN数据库在线分析PCMT1在胃癌组织的表达情况,通过DAVID数据库进行基因本体注释(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析其可能的功能与信号通路。纳入2014年1月–2017年12月于我院接受胃癌根治术的120例患者,免疫组织化学染色检测PCMT1、Ki67在胃癌组织中的表达;Cox回归、Kaplan-Meier曲线和受试者工作特征(ROC)曲线用于胃癌患者术后5年生存率的预后分析。采用慢病毒构建干扰或过表达PCMT1载体,转染人胃癌细胞系MGC-803与HGC-27细胞,设置干扰空载体(sh-NC)组与干扰PCMT1载体(sh-PCMT1)组,过表达空载体(LV-Vec)组与过表达PCMT1载体(LV-PCMT1)组;Western blot检测各组细胞中PCMT1、CyclinB1、CDC20蛋白表达,CCK-8法检测胃癌细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期。注射4组MGC-803细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,每组3只,测量体质量,14 d后处死裸鼠,测量肿瘤体积,Western blot法检测肿瘤组织中CyclinB1与CDC20蛋白表达水平。结果 UALCAN数据库分析示PCMT1在胃癌组织中高表达且在不同病理分期、分级与淋巴结转移的胃癌组织中均表达升高(P<0.05)。GO与KEGG富集示PCMT1主要参与有丝分裂、纺锤体组装检查点与细胞周期等信号。免疫组化结果显示PCMT1与Ki67在患者胃癌组织中呈高表达且二者呈正相关关系(P<0.05)。Cox多因素分析示PCMT1高表达[风险比(HR)=2.921,95%置信区间(CI):1.628~5.239]是影响胃癌患者术后5年生存率的独立危险因素之一。Kaplan-Meier曲线分析示高表达PCMT1的患者术后5年生存率(16.7%,HR=4.651,95%CI=2.846~7.601)低于低表达PCMT1患者(70.0%,HR=0.215,95%CI=0.132~0.351)。ROC曲线表明,PCMT1预测患者术后5年生存率的曲线下面积为0.764(95%CI:0.674~0.854)。Western blot对PCMT1的检测结果表明慢病毒干扰或过表达PCMT1细胞系构建成功。CCK-8结果表明下调PCMT1表达MGC-803与HGC-27细胞增殖能力减弱,过表达PCMT1则促进细胞增殖(P<0.05)。干扰PCMT1后CDC20蛋白表达下调,CyclinB1蛋白表达上升,细胞周期阻滞于G2/M期,而过表达则呈现相反趋势(P<0.05)。sh-PCMT1组裸鼠肿瘤的体积与质量减小,肿瘤组织CDC20蛋白表达降低,CyclinB1蛋白表达升高(P<0.05,与sh-NC组相比),LV-PCMT1组则呈相反趋势(P<0.05,与LV-Vec组相比)。结论 PCMT1在胃癌组织中呈高表达,与患者不良预后相关,可能通过调控细胞有丝分裂进程中纺锤体检查点影响肿瘤细胞恶性增殖。

14-3-3ε调节小鼠受精卵纺锤体组装

目的:研究14-3-3ε蛋白调节小鼠受精卵纺锤体组装的作用。方法:采用间接免疫荧光实验检测1-细胞期受精卵14-3-3ε和α-微管蛋白的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsi RNA注射入1-细胞期受精卵,观察小鼠受精卵纺锤体形态及检测Polo样激酶1(Plk1)的活性。结果:14-3-3ε和α-微管蛋白在G1期、S期和G2期卵中主要共定位于细胞质,M期卵14-3-3ε主要位于细胞质皮质。小鼠受精卵注射14-3-3εsi RNA后导致异常形态纺锤体形成及Plk1活性下降。结论:14-3-3ε蛋白在调节小鼠受精卵纺锤体组装中发挥重要作用。

纺锤体组装检验点:染色体稳定性的守护神

有丝分裂是真核生物进行细胞增殖的基本方式,其根本目的是准确无误地将复制好的染色体平均分配到两个子细胞中。在细胞有丝分裂过程中,纺锤体组装检验点的作用是产生"等待"信号,直至所有的染色体都排列到赤道板上并建立正确的双极定向,以确保染色体的均等分配。在高等动物中,细胞的纺锤体组装检验点功能行使异常,染色体分离将出现错误,导致子代细胞的染色体数量不稳定,进而诱发肿瘤或导致其他疾病的发生。纺锤体组装检验点一直以来都是细胞生物学家研究的热点,然而其作用的分子基础和调控因素还不是十分明了,该文将对近年来关于纺锤体检验点的研究进展进行总结和探讨。

哺乳动物卵母细胞纺锤体的形成及纺锤体检验点的作用机制

染色体精确分离是在纺锤体的正确组装和纺锤体检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)的监控下完成的,对于哺乳动物卵母细胞来说,纺锤体的形成和SAC都是保证染色体精确分离的重要因素,如果染色体分离错误将直接导致自发性流产或其他出生缺陷。卵母细胞中心体缺失后,细胞依然能够依靠独立于中心体而围绕染色体成核的微管反向平行排列能形成双极纺锤体,即自我组装纺锤体。由微观组织中心(microtubue organizing center,MTOC)召集微管聚集,成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)维持两次减数分裂过程中纺锤体的形成过程,细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)维持分裂中期结构,使纺锤体在染色体没有全部集合到赤道板时保持稳定。大体积的卵母细胞容易产生非整倍体,且卵母细胞中不含有中心体这一特殊性导致卵母细胞中是否存在SAC在很长一段时间内存在争议,但现在SAC是确保卵母细胞染色体精确分离的机制之一已被初步证明。在减数分裂中期染色体之间存在一种黏连,细胞会产生"等待-后期"信号抑制SAC活性,从而保持这种黏连稳定,直至所有染色体完成与纺锤体的连接,"等待-后期"信号失活,SAC启动,使染色体间的黏连失活,进而在纺锤体的作用下染色体分离。作者综述了减数分裂过程中纺锤体的特异性组装过程和纺锤体检查点的组成及作用机制,丰富了减数分裂的相关知识,并为减数分裂过程中非整倍体的形成机制提供依据。

小鼠卵母细胞减数分裂中心粒蛋白SAS-6的表达和亚细胞分布

目的研究在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中,中心粒蛋白SAS-6的蛋白表达模式和亚细胞定位分布。方法采用免疫荧光染色方法分析SAS-6在中国仓鼠卵巢细胞系(CHO细胞)有丝分裂过程中和卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞分布,及其与微管组织中心(MTOCs)和囊泡之间的相关性;通过Western blot测定SAS-6在小鼠卵母细胞减数分裂各阶段的蛋白质表达水平。结果在体细胞有丝分裂过程中SAS-6始终与中心粒周围蛋白Pericentrin保持共定位;在小鼠卵母细胞内SAS-6恒定表达于减数分裂的各个阶段并特异性聚集在高尔基体基质蛋白GM130阳性的囊泡上,而没有分布在MTOCs上。结论SAS-6可能在卵母细胞减数分裂过程中通过调节囊泡而参与纺锤体的趋皮质区迁移。

微管抑制剂诱导肿瘤细胞有丝分裂灾难研究进展

微管抑制剂一直是抗肿瘤药物研究的热点。微管抑制剂通过促进或抑制微管的聚合来破坏微管的动态平衡,阻碍肿瘤细胞纺锤体形成,阻滞细胞分裂进程从而发挥抗肿瘤作用。有丝分裂灾难是发生在细胞有丝分裂期,由细胞分裂异常和纺锤体结构的损伤而造成的细胞死亡现象。近年来,微管抑制剂能够诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾难已被临床证实,并越来越受到人们关注。现对微管抑制剂的最新研究进展进行综述,并探讨其诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾难死亡的分子机制。

CDC20在细胞分裂周期中的作用

CDC20是细胞周期相关蛋白之一。在细胞分裂周期中,CDC20是纺锤体组装检查点的靶向物和有丝分裂后期促进复合体的正调控因子,在引导细胞周期中某些蛋白质的泛素化降解和确保染色体正常分离的过程中起着重要的作用。

Ran的GTPase活性及其生物学功能研究进展

核内小分子GTP结合蛋白(a small nuclear GTP-binding protein,Ran)是一种分布于真核细胞核内含量十分丰富的小分子GTP酶,是Ras基因大家族中的一员。Ran具有多种生物学功能,参与调节核物质转运,调控核膜装配、纺锤体组装、DNA复制、RNA转录、加工和运输、细胞周期及LPS信号传导等。

GTP酶Ran在细胞核运输、核分裂与重建中的作用

小分子的单体G蛋白Ran具有鸟苷三磷酸酶活性,其结合形式Ran-GTP作为区分间期细胞的核质和胞质的一个分子标记,并参与调控核质运输、指导纺锤体形成以及引导核膜解体与装配。现就Ran在真核细胞核质运输、有丝分裂纺锤体组装与核膜动力学中的功能作一综述。

TTK/MPS1在恶性肿瘤中的表达及临床意义的研究进展

肿瘤的形成是由于细胞生长调控严重紊乱、染色体有丝分裂不稳定等多种因素共同导致细胞异常增生的结果。T细胞酪氨酸激酶(TTK)是纺锤体组装检查点(SAC)的核心部件,它能确保染色体向子细胞适当分布,平衡生长和分裂,是保证有丝分裂保真度和基因组稳定的一种蛋白激酶。当TTK过表达时,中心体增大,染色体不稳定,可导致肿瘤发生。TTK已被证实在胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中过表达。TTK在正常组织与癌组织中的差异性表达提示其具有临床诊断生物标记物的潜能,而TTK小分子抑制剂在动物模型中可以抑制肿瘤细胞的增殖,提示TTK具有肿瘤靶向治疗的潜力。本文将综述TTK在多种恶性肿瘤中的表达及临床意义的研究进展。