绿色荧光蛋白标记的犬脂肪干细胞体外复合珊瑚材料的生长特性

目的研究犬脂肪干细胞(AdiposeDividedStromalCells,ADSCs)作为种子细复合珊瑚材料体外培养的生长特性。方法分离犬ADSCs,成骨诱导并转染绿色荧光蛋白(GFP)后,复合珊瑚材料培养。检测细胞总数,激光共聚焦观察细胞形态。结果ADSCs-珊瑚复合物体外增殖良好。激光共聚焦显示培养2周后细胞呈老化形态。结论GFP转染不影响细胞传代、增殖。细胞-材料复合物体外培养7天后回植较为适宜。

增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞与表面置换珊瑚人工骨的培养

目的通过增强型绿色荧光蛋白(eGFP)标记的人骨髓间充质干细胞(MSC)与表面置换珊瑚羟基磷灰石(SCHA)培养,研究SCHA与细胞黏附、增殖的情况。方法将海南天然滨珊瑚在特定温度和压力下部分水热反应,制成SCHA。将SCHA薄片(SCHA组)和盖玻片(玻片组)分别与eGFP标记的人骨髓MSC体外培养,分别于4、8、12、16d进行死活细胞染色和Alamar Blue实验,用荧光显微镜观察细胞活性,荧光分光光度计测量细胞增殖。结果人骨髓MSC在SCHA的表面和孔道内生长良好,第8天、第16天与玻片组达同样水平,之后超过玻片组并保持稳定状态。结论SCHA无细胞毒性,具有较好的细胞相容性,是一种良好的骨组织工程支架材料。

珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研究和应用

绿色荧光蛋白作为标记蛋白和报告蛋白在生物学研究中应用越来越广。但在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)等技术中存在一些缺陷,需要更大波长范围的荧光蛋白。最近研究发现了多种来源于珊瑚和海葵的红荧光蛋白,这些长波长的荧光蛋白对绿色荧光蛋白是一种很好的代替和补充,可以实现细胞内多荧光标记,提供更理想的FRET荧光对。经随机突变和定点突变等方法改建获得的红荧光蛋白变种显示出更高的荧光强度,成熟时间也更短。目前应用较多的是来源于香菇珊瑚(Discosomasp.)的红荧光蛋白DsRed。

增强型绿色荧光蛋白标记技术示踪组织工程化骨形成

目的:观察以脂质体介导法转染的增强型绿色荧光蛋白质粒作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法:实验于2005-07/2006-11在南昌大学第二附属医院分子医学实验室完成。选取12个月龄中国青山羊2只作为骨髓基质干细胞供体。另取BACB/un裸鼠9只作为骨髓基质干细胞-珊瑚复合物受体。①将已转化pEGFP-N2大肠杆菌109菌种,进行质粒提取并经AvaⅡ酶切鉴定。②脂质体lipofectamine2000介导转染羊骨髓基质干细胞。分别于转染24h、6个月后计算荧光的转染效率。标记与未标记细胞经成骨诱导分化后,检测碱性磷酸酶活性和四环素钙结节染色,以未标记的同期细胞作对照。③将标记细胞接种于珊瑚支架,形成骨髓基质干细胞-珊瑚复合物,分别于体外培养4,7,14d后进行电镜扫描观察。④将体外培养7d的骨髓基质干细胞-珊瑚复合物移植于裸鼠皮下,8周后取出,荧光显微镜下进行示踪观察,苏木精-伊红染色观察组织结构。以未标记的骨髓基质干细胞-珊瑚复合物、单纯珊瑚作对照。结果:共纳入中国青山羊2只,BACB/un裸鼠9只,作为受体的9只裸鼠进入结果分析。①质粒经酶切后电泳,可见3条带,分别为445bp,1938bp,2354bp,确定所提质粒为pEGFP-N2。②转染24h后绿色荧光表达率35%;经G418筛选,转染6个月后绿色荧光表达率75%;与对照组相比,标记细胞碱性磷酸酶活性差异无统计学意义(P>0.05),均具有钙结节形成能力。③标记细胞与材料贴附生长良好,并分泌胶原纤维及钙盐结晶样基质。④组织学示新生骨样组织围绕材料孔隙生成;新生组织细胞内有绿色荧光表达,同时对照组未观察到绿色荧光。结论:脂质体介导法转染的pEGFP-N2标记骨髓基质干细胞,可用于裸鼠体内示踪,是一种理想的组织工程化骨组织的示踪方法。

人乳头状瘤假病毒中和抗体滴度和ELISA法测定的小鼠血清抗体滴度的相关性研究

目的探讨两种不同的报告基因纽扣珊瑚绿色荧光蛋白（Zoanthus sp．green fluorescent protein，ZsGreen）和分泌性碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）测量的人乳头状瘤假病毒中和滴度之间的相关性，以及中和滴度和抗体滴度的相关性。方法将密码子优化的人乳头状瘤病毒（HPV）衣壳蛋白L1、12基因表达质粒和报告基因质粒共转染293FT细胞，48h后收集细胞裂解上清，柱层析纯化假病毒，对假病毒滴度进行测定。采集免疫过候选HPV疫苗和Gardasil疫苗的小鼠血清，测量血清的中和滴度和抗体滴度。结果经统计分析，这两种报告基因系统的假病毒检测的中和滴度结果高度相关（Spearman相关系数r=0．760），而且中和滴度和抗体滴度的相关度很高（Spearman相关系数r=0．577和0．741）。结论两种不同的报告基因ZsGreen和SEAP测量的HPV假病毒中和滴度之间，以及中和滴度和ELISA测定的抗体滴度之间高度相关，揭示了部分HPV疫苗预防病毒入侵的机制，为快速准确鉴定HPV-16和HPV-18候选疫苗的免疫保护效果奠定了基础。

重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗免疫原性评价方法的研究

目的:探讨重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)候选疫苗免疫原性评价方法。方法:对以假病毒为基础的中和实验(Zs-Green法)测定血清中和滴度,以微球为基础建立的Luminex法测定中和滴度和ELISA法测定抗体滴度的3种方法进行相关性研究以及体内效价测定(ED50法)和体外相对效力测定(IVRP法)的相关性分析,同时对5种免疫原性的评价方法进行重复性验证。结果:ZsGreen法、Luminex法测定的中和滴度和ELISA法测定的抗体滴度检测结果表明:滴度值呈明显的剂量效应以及侯选疫苗具有良好的免疫原性。采用SPSS统计软件分析,对于HPV 16L1 ZsGreen法、Luminex法和ELISA法的相关系数分别为0.791,0.800,0.747(Spearman相关系数)和HPV 18L1的相关系数分别为0.734,0.625,0.634(Spearman相关系数)。并且ED50法和IVRP法具有一定的相关性。5种方法重复性验证的RSD分别为:5.3%(ZsGreen)、5.2%(Luminex)、8.0%(ELISA)、32.3%(ED50)、6.3%(IVRP)。结论:建立的HPV 16和HPV 18型疫苗评价方法为快速准确地评价免疫原性提供了多种解决方法。