全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性

焦磷酸测序是目前基因多态性检测的主要方法之一,但是其前期的样本制备工作较为繁琐,限制了其在临床检测中的应用。为了简化焦磷酸测序的流程,本研究根据不对称PCR原理,改进了线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)的引物设计方法,增加过量引物的长度和浓度,并结合全血直接扩增技术,建立了基于普通r Taq聚合酶和高p H缓冲液(Hp H Buffer)的全血改进LATE-PCR(Improved LATE-PCR,im LATE-PCR)方法。考察了方法的最优扩增体系、血液抗凝剂对其影响以及全血模板量。采用单管、一步法直接扩增出单链测序模板,成功地对24例临床血样的乙醇脱氢酶基因多态性进行了检测,检测结果可用于指导临床个体化用药。24例样本的基因型分别为ADH1B位点AA纯合6例、AG杂合14例、GG纯合4例;ADH1C位点GG纯合20例、AG杂合4例、AA纯合0例。

多色巢式实时荧光定量聚合酶链式反应技术为初始方法联合线性探针及表型药敏试验的二阶段流程检测耐药结核病的临床实践

目的评估以多色巢式实时荧光定量聚合酶链式反应技术(GeneXpert)为初始检测方法联合线性探针及表型药敏试验的二阶段检测流程在临床使用时对利福平耐药结核病的检出效果。方法回顾性收集并分析2019—2022年北京市朝阳区结核病门诊部登记的645例病原学阳性肺结核患者基本信息及实验室检测结果。参照《利福平耐药肺结核诊断流程》解读,将GeneXpert作为初始第一阶段利福平耐药检出方法,然后对未接受GeneXpert检测或检测结果显示结核分枝杆菌阴性或利福平耐药不明确的患者标本开展培养,并对培养阳性菌株开展线性探针耐多药检测和微孔板法进一步进行利福平耐药检测的第二阶段检测流程。对二阶段流程中检出的利福平耐药菌株进行利福平、异烟肼、左氧氟沙星、莫西沙星4种药物比例法药敏试验。分析二阶段检测流程对利福平耐药检出情况及利福平耐药患者对其他药物的耐药谱。结果645例病原学阳性患者的利福平耐药检测率为95.97%(619/645),利福平耐药检出比例为7.59%(47/619)。其中第一阶段GeneXpert法检出87.23%(41/47)利福平耐药患者,而第二阶段线性探针和微孔板法共检出12.77%(6/47)利福平耐药患者。47例利福平耐药病例中37例培养阳性,经4种药物比例法药敏检测显示,7例为单耐利福平,26例为同时耐利福平和异烟肼,2例为准广泛耐药。结论以GeneXpert为初始检测方法联合后续培养及线性探针和/或表型药敏试验的二阶段检测流程有助于检出更多利福平耐药患者。

激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件

寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤。本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF),通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察,研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素,并对其进行优化。结果表明,随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同,其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外,初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同。因此,在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化。本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为:初始模板的量为105个分子,DNA聚合酶浓度0.05U/μL,退火温度70℃,18个循环。本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子,降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据。

动脉粥样硬化候选基因屏氧酶1基因192位Gln-Arg多态性对血脂的影响

目的:探讨屏氧酶1基因192位Gln-Arg多态性与血脂水平的关系。方法:从社区正常人群、健康体检者和患者中抽取1019例受试者,其中680例脑卒中患者及339例正常对照组人群,男606例,女413例。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法测定屏氧酶1基因多态性。结果:非心脑血管病、脑出血、脑梗死患者年龄、性别、体质量指数、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇比较,差异无显著性意义(P>0.05),三者血清空腹血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇比较,差异有显著性意义(P<0.05)。屏氧酶13种基因型(QQ,QR,RR基因型)各血脂水平差异无显著性意义(P>0.05),其中QQ基因型的三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平分别为(1.58±0.89),(4.82±1.01),(1.39±0.38)和(2.84±0.75)mmol/L;QR基因型分别为(1.59±0.99),(4.78±1.00),(1.36±0.38)和(2.82±0.80)mmol/L;RR基因型分别为(1.57±0.87),(4.84±1.05),(1.34±0.39)和(2.87±0.87)mmol/L。同一性别不同基因型之间各血脂水平差异无显著性意义(P>0.05)。男女两性屏氧酶1各基因型的比例相近(P>0.05)。男女不同性别之间屏氧酶1基因各基因型的血脂水平存在差异,尤其以高密度脂蛋白胆固醇明显(P<0.05)。结论:屏氧酶1基因192位Gln-Arg各基因型间血脂水?

冠心病相关炎性因子与冠心病患者TIPE2 mRNA水平的关系

目的:探讨冠心病患者血浆中相关炎性因子与外周血单个核细胞(PBMCs)中TIPE2 mRNA的关系。方法:选取2010年12月至2012年11月期间在我院行冠脉造影检查明确冠脉狭窄的患者100例,及冠脉无明显狭窄的非冠心病者30例。采用ELISA法测定血浆中相关炎性因子的表达水平,采用PCR法测定PBMCs中TIPE2 mRNA水平。结果:(1)两组间VCAM-1、MMP-9、MCP-1、TNFα、IL-1、6、8细胞因子具有显著性差异;(2)TIPE2 mRNA结果:冠心病组中TIPE2 mRNA水平明显低于非冠心病组;(3)炎性因子与TIPE2 mRNA的相关性:VCAM-1、MMP-9、MCP-1、IL-1、6细胞因子对TIPE2具有显著性影响(P<0.05)。结论 :提示TIPE2可能通过调节VCAM-1、MMP-9、MCP-1、IL-1、6细胞因子的水平发挥抗动脉粥样硬化的作用。

妊娠期龈炎中牙龈卟啉单胞菌的表达水平

目的探讨牙龈卟啉单胞菌在不同孕期的妊娠期龈炎中的作用,为妊娠期龈炎的防治提供相关依据。方法依照世界卫生组织(WHO)制定的口腔健康基本调查方法,对240例妊娠期龈炎妇女进行口腔检查,评估并记录相应的牙龈健康指标(GI、SBI)和牙体健康指标(DMFT、DMFS);采集龈沟液标本,用PCR技术检测牙龈卟啉单胞菌的表达水平。结果早孕/中孕/晚孕3组中,晚孕组的牙龈指标(GI=1.28±0.35,SBI=0.89±0.37)最高(P<0.05),患龋指标(DMFT=1.85±0.98,DMFS=2.90±1.82)最高(P<0.05),牙龈卟啉单胞菌的数量最多(P.g CT=0.0521±0.0017,P<0.05)。早孕/中孕/晚孕3组中,牙龈指标GI,SBI与牙龈卟啉单胞菌的数量均呈正相关(均P<0.05)。结论怀孕的时间越长,妊娠期龈炎的症状越严重,牙龈卟啉单胞菌的数量也越多,推测牙龈卟啉单胞菌在妊娠期龈炎的发展中扮演着重要的角色。

基于PCR-DGGE技术分析不同深度土壤层细菌的群落结构

为了研究不同深度土壤中微生物的多样性以及优势菌群,采集来自于不同深度的土壤样品,利用SDS苯酚/氯仿/异戊醇提取土壤中总DNA。扩增16SrDNA的V3可变区,变性梯度凝胶电泳进行分析。结果表明:土壤层自下向上各层香农指数分别为1.56、1.59、1.54、1.57、1.57、1.57、1.59、1.54、1.59、1.59、1.59。不同深度土壤层优势菌群数量和种类经测序分析并将结果在NCBI数据库比对,主要的优势菌属为Thermoanaerobacterales、Thermoanaerobacteraceae、Cyanobacteria、Firmicutes、Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Oscillatoriophycideae、Clostridia、Deltaproteobacteria、Desulfobacterales。

四君子汤及其单味药水煎液对脾虚大鼠肠道菌群的调节作用

目的:探讨四君子汤及其单味药(人参、白术、茯苓、炙甘草)水煎液对脾虚大鼠肠道菌群的调节作用。方法:正常大鼠随机分为空白组、模型组、整肠生颗粒组、四君子汤组及各单味药组,连续10 d灌胃给予番泻叶水煎液塑造脾虚模型(空白组给予蒸馏水),再连续7 d分别给予相应药物治疗(空白组、模型组给予蒸馏水)。收集造模前(第0天),造模结束(第11天)和治疗结束(第18天)的粪便样品,经硫酸酸化、乙醚萃取处理后采用气相色谱法分析样品中短链脂肪酸含量的变化,利用16S rDNA-聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析粪便样品中肠道菌群结构的变化。结果:造模结束时,与空白组比较,各给药组大鼠粪便短链脂肪酸含量、肠道菌群多样性指数和相似性系数均显著下降(P <0. 05,P <0. 01),表明脾虚模型造模成功。治疗结束时,与模型组比较,白术组大鼠粪便短链脂肪酸含量、肠道菌群多样性指数和相似性系数均极显著升高(P <0. 01),四君子汤组、人参组和茯苓组部分指标极显著升高、部分指标显著升高(P <0. 05,P <0. 01);而炙甘草组仅多样性指数有所升高(P <0. 05),粪便短链脂肪酸含量和相似性系数则均无显著性差异。结论:四君子汤对脾虚大鼠肠道菌群的恢复调节时,白术可能发挥主要作用,人参、茯苓也发挥了一定作用。