针刺激活轴抑制蛋白1、腺苷酸活化蛋白激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路对失神经骨骼肌萎缩大鼠的保护作用

目的研究针刺对失神经骨骼肌萎缩大鼠骨骼肌细胞丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、轴抑制蛋白1(Axin1)表达水平的影响。方法将48只SD大鼠采用简单随机分组分为空白对照组、假手术组、模型组和针刺组各12只。模型组和针刺组大鼠采用手术切断坐骨神经制备失神经骨骼肌萎缩大鼠模型,假手术组只暴露坐骨神经,空白对照组不做任何处理。针刺组在造模后进行电针治疗(“足三里”和“承山”穴),每次10 min,连续治疗3周。治疗后,检测各组大鼠绯肠肌组织的湿重比、肌纤维横截面积及肌细胞直径比;HE染色检测各组大鼠绯肠肌损伤;TUNEL染色检测各组大鼠绯肠肌细胞凋亡;蛋白质印迹法(Westernblotting)检测p-AKT、AKT、p-AMPK、AMPK、Axin1、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶(cleavedcaspase-3)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达。结果与空白对照组和假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌湿重比(0.38±0.06)、肌纤维截面积比(0.52±0.12)和肌纤维直径比(0.53±0.16)均明显下降(P<0.05),细胞凋亡率(30.85±5.74)%明显升高(P<0.05),Bcl-2(0.40±0.03)、Bax(0.53±0.05)、cleavedcaspase-3(0.58±0.06)、PCNA(0.44±0.05)、p-AKT/AKT(0.54±0.06)、p-AMPK/AMPK(0.73±0.04)和Axin1(0.41±0.05)的表达明显上调(P<0.05);与模型组相比,针刺组大鼠腓肠肌湿重比(0.52±0.07)、肌纤维截面积比(0.64±0.11)和肌纤维直径比(0.66±0.15)均明显增加(P<0.05),细胞凋亡率(21.39±3.87)%明显下降(P<0.05),Bcl-2(0.61±0.05)、PCNA(0.72±0.08)、p-AKT/AKT(0.82±0.09)和Axin1(0.62±0.06)的表达明显上调(P<0.05),Bax(0.33±0.04)、cleavedcaspase-3(0.34±0.04)和p-AMPK/AMPK(0.51±0.03)的表达明显下调(P<0.05)。结论针刺可能通过调控Axin1/AMPK/AKT的表达,延缓失神经大鼠骨骼肌的萎缩。

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主丝/苏氨酸蛋白激酶N1相互作用的鉴定

为筛选并鉴定与猪瘟病毒(CSFV)衣壳(C)蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术以CSFV C蛋白为诱饵从猪外周血单个核细胞(PBMC)c DNA表达文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白,共筛选到6种蛋白,分别为ATP5B、SON3、PKN1、PCBP1、RPS20和IQGAP1,根据Gene Ontology分析结果,这些蛋白分别参与细胞的增殖和代谢等过程。本研究选取丝/苏氨酸蛋白激酶N1(PKN1)进行进一步验证,经酵母共转化试验、免疫共沉淀试验和GST pull-down试验证实,宿主PKN1蛋白与CSFV C蛋白之间存在特异性结合。本研究首次证明PKN1与CSFV蛋白之间的相互作用关系,为进一步研究PKN1蛋白在CSFV感染过程中发挥的作用奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达

为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Eimeria tenella serine/threonine protein kinase,Et STK)基因的真核表达重组质粒,并实现在DF-1细胞中的表达,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增Et STK基因,将扩展产物与真核表达质粒pc DNA3.1-flag连接,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-flag-Et STK,测序鉴定正确后,转染DF-1细胞进行表达,利用Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofl uorescene assay,IFA)对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pc DNA3.1-flag-Et STK构建成功。Western blot显示在54 k Da处出现条带;IFA检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pc DNA3.1-fl ag-Et STK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的 探讨RNA干扰技术(RNAi)沉默肺腺癌转移相关转录本-1(MALAT-1)基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路影响。方法体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞,命名为si-NC组、si-MALAT1组,未处理组作为空白对照组,分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bax、caspase-3mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其磷酸化蛋白(p-PI3K)、Akt及其磷酸化蛋白(p-Akt)蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果 与正常细胞相比,喉癌Hep-2细胞中MALAT-1mRNA表达水平(3.24±1.02)升高(P<0.05);与空白对照组、si-NC组相比,si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1mRNA表达水平(0.47±0.08)及Bcl-2mRNA(0.56±0.09)及蛋白(0.31±0.05)表达降低,细胞增殖抑制率及凋亡率[(20.48±3.41)%]均升高,Bax、caspase-3mRNA(3.02±0.50、2.58±0.43)及蛋白表达(0.86±0.14、0.94±0.16)均升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达(0.57±0.10、0.51±0.08)均降低(P均<0.05)。结论 MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率,推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。

胰岛素调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1信号通路对急性肺损伤小鼠肺水肿的清除作用

目的 探讨胰岛素通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(serine/threonine protein kinase-1,SGK1)减轻急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠肺水肿的机制。方法 将32只雄性成年C3H/HeN小鼠随机分为对照组(仅泵入与治疗组等量的生理盐水)、ALI组(建模后持续泵入与治疗组等量的生理盐水)、治疗组[建立ALI模型后,持续经颈静脉泵入胰岛素0.1 U/(kg·h)]和SGK1 siRNA组[建立ALI模型后,持续泵入胰岛素0.1 U/(kg·h)的同时,给予SGK1 siRNA(75μg SGK1 siRNA稀释于100μL生理盐水中)],每组8只。8 h后处死小鼠,进行动脉血气分析(模型建立1 h后),并检测血糖变化情况(0、1、4、8 h);收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),检测其中总蛋白含量,并测定肺泡上皮通透性和肺水含量;观察肺组织病理学改变和肺上皮细胞凋亡情况;Western blot法测定肺泡上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)和α_(1)-钠/钾ATP酶(α_(1)-Na^(+),K^(+)-ATPase)蛋白表达以及SGK1磷酸化水平。结果 泵入胰岛素后0、1、4、8 h,ALI与治疗组小鼠血糖水平差异均无统计学意义(t分别为1.330 0、0.986 0、0.565 7和0.724 3,P分别为0.204 7、0.340 7、0.580 6和0.480 8)。与ALI组比较,治疗组小鼠动脉血氧分压显著升高(t=6.026,P <0.000 1),BALF蛋白含量、肺泡上皮通透性、肺水含量和肺上皮细胞凋亡显著减少(t分别为7.39、5.286、5.651和3.312,P分别为<0.000 1、0.000 4、0.000 2和0.007 8),肺组织中α-ENaC和α_(1)-Na^(+),K^(+)-ATPase蛋白表达及SGK1磷酸化水平显著升高(t分别为26、18.67和8.547,P分别为<0.000 1、<0.000 1和0.000 1);与治疗组比较,SGK1 siRNA组小鼠BALF蛋白含量、肺泡上皮通透性、肺水含量和肺上皮细胞凋亡显著增加(t分别为5.964、3.449、3.148和3.520,P分别为0.000 2、0.006 2、0.010 4和0.016 9),α-ENaC和α_(1)-Na^(+),K^(+)-ATPase蛋白表达及SGK1磷酸化水平显著降低(t分别为13、9.874和7.741,P分别为<0.000 1、<0.000 1和0.001 5)。结论 外源性胰岛素能减轻ALI小鼠的肺水肿,其机制可能是通过SGK1上调α-ENaC和α_(1)-Na^(+),K^(+)-ATPase的表达实现。

p21活化蛋白激酶与心血管疾病:从病理生理学到药物发现(英文)

在全世界范围内,心血管疾病的发病率和死亡率一直都是排在首位的。从心脏信号转导这一新兴领域寻找新疗法的可能性促使人们在过去几十年中对心肌重塑开展了广泛深入研究。本综述将对一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶——p21活化激酶1(Pak1)——在心脏方面,特别是其心脏保护作用的研究进展作一回顾。我们提出一种Pak1信号转导模型,揭示其特异性影响心脏细胞进程的机制;进而从抗心肌肥厚,抗缺血性损伤以及在生理条件、β-肾上腺素能和肥厚性应激条件下维持心室钙稳态和电生理稳定性的角度探讨它的心脏保护作用。此外,还将通过天然存在的鞘氨醇及其类似物FTY720,以及旨在减少Pak1自抑制而设计的生物活性肽的研究实例来讨论Pak1激活作为心血管疾病新型疗法以及开展药物研发的可能性。

肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt和缺氧诱导因子1α蛋白表达

目的:观察肺岩宁方对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号调节的影响。方法:32只A549荷瘤裸鼠随机分为4组:模型组、顺铂组、肺岩宁方组和综合治疗(顺铂加肺岩宁方)组,每组8只。化疗组和综合治疗组于第1、3、5天腹腔注射顺铂各0.1mg,肺岩宁方组和综合治疗组予肺岩宁方0.4ml灌胃,持续21d。观察抑瘤率,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reac-tion,RT-PCR)检测移植瘤中HIF-1α mRNA表达,免疫组化法检测移植瘤中HIF-1α和磷酸化Akt(phos-phorylated Akt,p-Akt)蛋白表达。结果:肺岩宁方组裸鼠抑瘤率为34.17%,综合治疗组为64.38%。RT-PCR结果显示,综合治疗组HIF-1α mRNA的表达水平低于模型组(P<0.05)。免疫组化实验显示,化疗组、肺岩宁方组和综合治疗组移植瘤HIF-1α蛋白表达均明显低于模型组(P<0.01);肺岩宁方组和综合治疗组p-Akt蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)。结论:益气养精法为主的肺岩宁方可抑制肺癌肿瘤生长,并与顺铂有协同作用。肺岩方对HIF-1α蛋白表达的抑制作用可能与下调p-Akt表达有关。

微小RNA-1243直接靶向丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶1和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶2调节甲状腺乳头状癌TPC-1细胞迁移

目的观察微小RNA（miRNA，miR）-1243调节丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶1（Akt1）和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶2（Akt2）在人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中的表达及对细胞迁移的影响。方法利用TargetScan和miRanda对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株的miR-1243靶基因进行预测，采用双荧光素酶报告基因验证miR-1243对靶基因的直接调控。Western blot检测miR-1243对Akt1和Akt2蛋白表达的调节。迁移小室（Transwell）检测1×10^5个对数生长期的TPC-1细胞的迁移能力。结果TargetScan和miRanda软件预测显示Akt1和Akt2基因是miR-1243的潜在靶基因。双荧光报告基因的相对荧光值显示，与空载体组和突变组比较，分别共转染miR-1243模拟物的Akt1或Akt2野生型组荧光素酶活性显著下降（t=3.595，P=0.009），而空载体组和突变组的荧光素酶活性差异无统计学意义（t=1.655，P=0.213）。与对照处理组比较，miR-1243模拟物处理组显著抑制而miR-1243抑制物处理组促进TPC-1细胞Akt1和Akt2蛋白水平的表达（t=4.810，P=0.018），而内参基因蛋白水平均无明显变化（P=0.235）。Transwell实验结果显示，miR-1243模拟物转染组迁移细胞数[（9.83±3.51）个]低于对照模拟物处理组[（18.67±4.24）个]，差异均有统计学意义（t=2.692，P=0.039）。与对照抑制物处理组比较[（21.33±5.35）个]，miR-1243抑制物转染组迁移细胞数[（37.17±7.33）个]显著增加（t=2.472，P=0.022）。结论miR-1243通过靶向抑制Akt1和Akt2的表达进而调节TPC-1细胞迁移。

Pink1/Parkin介导线粒体融合发生线粒体自噬的研究进展

肿瘤、心血管系统和神经退行性疾病严重危害人类的健康,线粒体自噬在上述疾病的发生发展中发挥着重要作用,但其分子机制依然不明。在帕金森病患者的黑质中,PTENinduce putative kinase 1(Pink1)和Parkin基因经常发生突变或者缺失,对神经元的数量减少起到关键作用[1]。Parkin(E3ubiquitin ligases)是一种E3泛素连接酶,通过其域间相互作用被天然抑制,并且通过两个平行的激活步骤刺激Parkin Ubl域中的Ser65的磷酸化和pUb结合,Parkin的Ubl结构域和泛素被磷酸化相反调控(图1)[2],主要参与线粒体形态学、线粒体动力学和自噬等细胞生理活动,它也是Pink1的下游蛋白[3]。Pink1是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,其与自噬、凋亡、氧化应激、释放突触递质和线粒体钙离子稳态等有密切联系。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11研究进展与糖尿病的关系

APN与IR呈负相关,是参与糖尿病发生发展的重要分子,而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(STK11)编码蛋白—肝脏激酶B1(LKB1)是APN信号传导通路中的关键分子。LKB1蛋白通过激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)等抑制炎症因子,在调节能量代谢和细胞增殖方面都具有一定作用。在糖尿病方面,STK11及LKB1蛋白具有延缓糖尿病及并发症发生发展的作用,近期研究发现,LKB1不但能调节β细胞功能,且影响α细胞胰升血糖素的分泌。本文对STK11及LKB1蛋白的结构、信号转导通路、生理作用及在糖尿病中作用的研究进展进行综述。

丝/苏氨酸蛋白激酶Polo-like Kinase 1研究进展

Plk1是真核生物细胞分裂的重要调控因子。RNA干扰和小分子抑制剂等新技术的应用增加了对Plk1在有丝分裂中功能、底物和调控机制的认识。Plk1不仅在有丝分裂早期参与调节中心体成熟和双极纺锤体的形成,而且在胞质分裂、DNA损伤检验点甚至DNA复制中也有重要作用。该综述比较全面地讨论了Plk1在细胞分裂周期中的作用,重点介绍了Plk1在有丝分裂后期和间期作用的新发现,并就Plk1作为抗肿瘤药物作用靶点的研究进展做了总结。

磷脂酰肌醇-3-激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／内皮型一氧化氮合酶信号通路在二氮嗪后处理缺血／再灌注大鼠心肌中的作用

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／内皮型一氧化氮合酶（phosphatidylinositol-3-kiHase／protein serine threonine kinase／endothelial nitric oxide synthase，P13K／Akt／eNOS）信号通路在二氮嗪后处理大鼠在体心肌缺血/再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤中的作用。方法40只雄性sD大鼠完全随机分为5组，每组8只：假手术组（s组）、I／R组、二氮嗪组（D组）、P13K抑制剂渥蔓菁霉素组（w组）和二氮嗪＋渥蔓菁霉素组（DW组）。结扎左冠状动脉前降支30min、再开放120min，建立在体心肌I／R损伤模型，s组不结扎。再灌注5min前，5组依次分别经股静脉输入0．1％二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）1ml／kg、0．1％DMSO 1ml／kg、二氮嗪7mg/μg、渥蔓菁霉素15μg／kg，DW组于输入二氮嗪前5min输入渥蔓菁霉素；所有药物均输注15min。再灌注末，测定血浆心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）浓度，苏木精咿红（HE）染色观察心肌病理变化，免疫组化分析eNOS的表达情况。结果与s组比较，其余4组cTnI显著增高（JP如．01），心肌明显损伤，eNOS表达增高（P〈0．05或P〈0．01）.与I／R组比较，D组和DW组cTnI[（36．5±5．2）μg/L与（44．5±4．5）μg/L vs（64．7±11．1）μg／L]明显降低（P〈0．01），心肌病理改变减轻，eNOS表达增高[（0．515±0．136）％与（0．394±0．100）％VS（0．241±0．077）％]（P〈0．01）。与D组比较，DW组cTnI明显增高[（44．5±4．5）μg/L VS（36．5±5．2）μg/L]（P〈O．05），心肌损伤加重，eNOS表达降低[（0．394±0．100）％VS（0．515±0．136）％]（P〈0．01）。结论二氮嗪后处理减轻大鼠心肌I／R损伤的作用部分与P13K／Akt／eNOS信号通路激活有关。

内皮素1受体拮抗剂通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路减轻兔单肺通气时肺损伤的研究

目的 探讨调控磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-缺氧诱导因子1α(phosphatidylinositol 3-kinase-serine threonine protein kinase-hypoxia inducible factor 1 alpha,PI3K-Akt-HIF-1α)信号通路对减轻内皮素1受体拮抗剂BQ-123预处理的兔单肺通气(one-lung ventilation,OLV)时肺损伤的作用。方法 20只健康日本大耳白兔,雌雄不限,随机分为对照组、OLV组、OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组,每组5只。对照组兔持续双肺通气2.5 h,OLV组、OLV+BQ-123组及OLV+BQ-123+LY294002组先行右侧OLV 2 h,再恢复双肺通气0.5 h。OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组兔在OLV前10 min经股静脉注射BQ-123 50μg/kg,OLV+BQ-123+LY294002组在给予BQ-123前静脉输注磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的特异性抑制剂(LY294002) 0.3 mg/kg,输注时间为5 min。实验结束后留取左侧肺组织,称重计算湿/干比(wet-to-dry,W/D),行病理学切片并评估肺损伤程度;采用Western blot测定PI3K-Akt-HIF-1α信号通路关键因子磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine protein kinase,p-Akt)及缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)蛋白表达。结果 与对照组比较,OLV组兔肺水肿状态、W/D、肺损伤病理评分增加,p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量下调(P均<0.05);BQ-123预处理干预后,OLV+BQ-123组兔肺损伤程度、W/D下降、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05),且较OLV+BQ-123+LY294002组兔肺损伤程度、W/D降低、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05)。结论 内皮素1受体拮抗剂BQ-123通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路可减轻兔OLV时非通气侧的肺损伤。

非小细胞肺癌组织中AKT1、PDCD4蛋白表达变化及意义

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中丝/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和程序性细胞死亡因子4(PDCD4)蛋白表达变化,并探讨其临床意义。方法收集65例NSCLC患者的手术切除肿瘤组织为NSCLC组,30例受检者的正常肺泡组织为肺泡对照组,30例受检者的正常支气管断端组织为支气管对照组。用免疫组化法检测三组标本中的AKT1、PDCD4,并分析NSCLC组二者表达与肿瘤临床病理参数的关系。结果与支气管对照组和肺泡对照组相比,NSCLC组AKT1表达升高,PDCD4表达降低,P均<0.05。NSCLC组AKT1表达与NSCLC分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关(P均<0.05),与患者的性别、年龄和肿瘤的大小、组织学类型无关;NSCLC组中PDCD4表达与NSCLC组织学类型有关(P<0.05),与患者的性别、年龄和肿瘤的大小、分化程度、淋巴结转移及TNM分期无关;AKT1和PDCD4在肺腺癌组织中表达呈负相关(r=-0.436,P=0.021),在肺鳞癌组织中无关(r=-0.012,P=0.931)。结论 NSCLC组织中AKT1表达升高、PDCD4表达降低,联合检测两者有助于NSCLC的诊治和预后判断。

肝激酶B1通过下调细胞周期素D1抑制大肠癌细胞的体外增殖

目的:研究肝激酶B1(LKB1)基因对大肠癌细胞增殖的影响。方法:用脂质体转染法将LKB1基因表达质粒(pReceiver-LKB1)瞬时转染SW1116及SW480细胞,半定量RT-PCR及Western blot方法检测LKB1 mRNA和蛋白水平的表达;CCK8法检测SW1116及转染重组质粒的细胞体外增殖变化;半定量RT-PCR和Western blot方法检测胞内LKB1对细胞周期蛋白cyclin D1的影响。结果:转染LKB1基因后,质粒转染组LKB1表达较空质粒组及空白对照组明显升高;质粒转染组在转染后48、72、96 h时,细胞活性较空质粒组及空白对照组明显降低(P<0.01);与对照组相比,质粒转染组的细胞内cyclin D1 mRNA和蛋白的表达明显降低。结论:LKB1可抑制大肠癌细胞的体外增殖能力,并且这一抑制效应可能通过下调cyclin D1产生。

胰岛素样生长因子-1对β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme1,BACE1)的影响以及可能的细胞信号机制。方法:用不同剂量IGF-1(20、40 ng/ml和80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24 h,荧光定量PCR及Western blot检测BACE-1mRNA及蛋白水平;Western blot检测淀粉样前体蛋白、C99、C83及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3-kinase/serine threonine kinase,PI3-K/Akt)通路相关蛋白的水平;ELISA检测细胞培养液中β-淀粉样蛋白42(β-amyloid peptide,Aβ42)的水平,然后选择最佳剂量的IGF-1(80 ng/ml)作用于人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在此之前30 min加入PI3-K抑制剂LY294002(25μmol/L及50μmol/L),重复上述检测。结果:IGF-1降低BACE-1、C99及Aβ42的水平(P=0.000),提高C83的表达(P=0.000),增加Akt的磷酸化(P=0.000),而LY294002具有抑制IGF-1的上述作用。结论:IGF-1降低BACE-1mRNA及蛋白的水平,其机制可能涉及PI3-K/Akt信号通路。

外源性硫化氢对嗜铬细胞瘤细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的观察外源性硫化氢(H2S)对嗜铬细胞瘤细胞(PC12)β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响,并探讨可能涉及的细胞信号机制。方法用不同浓度的硫氢化钠(NaHS)处理体外培养的PC12细胞,利用RT-PCR和Western blot法检测细胞内BACE1mRNA及蛋白表达;继以LY294002和PD98059分别阻断磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Ak)t及丝裂酶原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)通路,Western blot法检测其对NaHS诱导的通路下游蛋白Akt1和ERK1/2磷酸化的影响及其对BACE1蛋白表达变化的调节;ELISA法检测细胞培养液中Aβ42水平的变化。结果 NaHS在实验浓度范围内呈剂量依赖性下调BACE1mRNA及蛋白表达,200μmol/L时最明显,各NaHS组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);LY294002抑制NaHS诱导的Akt1蛋白磷酸化,削弱NaHS对BACE1蛋白的下调作用,其表达在LY294002预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);而PD98059虽能抑制NaHS导致的ERK1/2蛋白磷酸化,但对其调节BACE1蛋白表达无影响,PD98059预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05);不同处理条件下的Aβ42表达与BACE1变化趋势基本一致。结论外源性H2S下调PC12细胞BACE1表达,其机制可能与PI3-K/Akt信号通路的激活有关,而与MAPK/ERK1/2通路无关。

Rac1蛋白参与2型糖尿病发病

Rac1即Ras相关的C3肉毒素底物1,是Rho GTP酶家族Rac亚家族成员之一。Rho家族GTP酶是一类分子量为20-30 ku的单体G蛋白,又称小G蛋白。Rac1是细胞内重要的信号转导分子,其激活与一些疾病如2型糖尿病密切相关。本文就Rac1参与肌动蛋白骨架重构、参与调控NADPH氧化酶类及Rac1活化影响骨骼肌葡萄糖转运体-4调控葡萄糖摄取及其参与2型糖尿病的发病机制进行了综述。

抑制TAK1可加重甲苯二异氰酸酯诱导的哮喘小鼠气道炎症

目的探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对甲苯二异氰酸酯(TDI)哮喘小鼠气道炎症的影响。方法建立TDI哮喘小鼠模型,为探讨TAK1在TDI哮喘模型中的作用,将32只小鼠随机分为4组(8只/组):AOO组,AOO+5Z-7-Oxozeaenol组,TDI组,TDI+5Z-7-Oxozeaenol组;为进一步探讨RIPK1在体内模型的作用,将另外32只小鼠随机分为4组(8只/组):AOO组,TDI组,TDI+5Z-7-Oxozeaenol组,TDI+5Z-7-Oxozeaenol+Necrostatin-1组。每次激发前使用TAK1抑制剂(5Z-7-Oxozeaenol,5 mg/kg)和/或RIPK1抑制剂(Necrostatin-1,5 mg/kg)。检测各组小鼠气道反应性、气道炎症及气道重塑等指标。体外实验:配制TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)复合物联合TAK1抑制剂处理小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),通过CCK8检测各组细胞活力,通过Westernblot检测各组TAK1、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及受体相互作用丝/苏氨酸蛋白酶1(RIPK1)相关信号通路分子表达情况;使用RIPK1抑制剂进一步评估对细胞活力及TDI哮喘模型的影响。结果与单独TDI致敏激发哮喘小鼠相比,TAK1抑制剂加重了小鼠气道炎症、气道高反应性及气道重塑(P<0.05)。抑制TAK1降低了RAW264.7细胞活力,与TDI-HSA共同处理进一步降低(P<0.05)。抑制TAK1降低了TDI-HSA诱导的TAK1磷酸化水平及MAPK信号通路的活化(P<0.05)。TAK1抑制剂与TDI-HSA共同处理后,RIPK1磷酸化水平升高,同时Caspase 8持续活化(P<0.05);使用RIPK1抑制剂可以恢复TAK1抑制剂与TDI-HSA共同处理引起的细胞活力的减低(P<0.05)。体内RIPK1抑制剂亦可以减轻TAK1抑制剂对TDI哮喘小鼠气道炎症的加重(P<0.05)。结论抑制TAK1可能通过增加RIPK1的活性,引起Caspase 8的持续活化而增加巨噬细胞的死亡,参与促进TDI诱导的哮喘小鼠气道炎症。

转化生长因子β1对膀胱癌细胞增殖与迁移能力的影响及其机制

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对膀胱癌T24细胞增殖、迁移能力的影响及其机制。方法以浓度为0、1、5、10、20、40μg/L的TGF-β1处理T24细胞24 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性,采用细胞划痕方法检测其迁移能力,采用Western blot检测细胞中程序性死亡配体-1(PD-L1)蛋白的相对表达量;使用浓度为5μg/L的TGF-β1处理T24细胞0、0.5、1、2、6、24 h,采用Western blot实验检测细胞PD-L1蛋白及磷酸化丝苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)和磷酸化细胞外调节激酶(p-ERK)蛋白的相对表达量;将T24细胞分为A~C组,A组使用正常培养基培养,B组培养基中加入终浓度为5μg/L的TGF-β1培养,C组培养基加入终浓度为5μg/L的TGF-β1及SB431542培养,Western blot方法检测A~C组细胞中PD-L1相对表达量;将T24细胞分为D~G组,D组使用正常培养基培养,E组培养基中加入终浓度为5μg/L的TGF-β1培养,F组培养基中加入终浓度为5μg/L的TGF-β1、AKT抑制剂MK2206培养,G组培养基加入终浓度5μg/L的TGF-β1、ERK抑制剂U0126处理T24细胞,均处理24 h,Western blot方法检测D~G组细胞中p-AKT、p-ERK和PD-L1相对表达量。结果浓度0、1、5、10、20、40μg/L的TGF-β1处理T24细胞24 h,其他浓度的TGF-β1处理T24细胞的增殖能力相较于0μg/L时均显著增强(t=3.59~12.18,P<0.05),各浓度之间T24细胞的迁移率没有显著差异(P>0.05),浓度为5μg/L时相较于其他浓度,PD-L1蛋白表达明显升高(t=3.22~5.64,P<0.05);浓度为5μg/L的TGF-β1处理T24细胞0、0.5、1、2、6、24 h后,T24细胞PD-L1蛋白表达随时间延长逐渐升高(F=199.20,P<0.05),并且处理时间为0.5 h相较于其他处理时间,p-AKT、p-ERK表达量显著升高(t=6.26~64.24,P<0.05);B组与A组比较,T24细胞PD-L1蛋白表达水平明显升高(t=31.24,P<0.05),C组与B组比较,PD-L1蛋白的表达水平降低(t=17.04,P<0.05);E组与D组比较,T24细胞的PD-L1、p-AKT、p-ERK蛋白水平明显升高(t=9.44~37.29,P<0.05),G组与E组比较,p-AKT、PD-L1蛋白表达水平显著降低(t=104.40、6.74,P<0.05);F组与E组比较,p-ERK、PD-L1蛋白表达水平显著降低(t=24.26、17.01,P<0.05)。结论TGF-β1可以促进膀胱癌T24细胞增殖和细胞内PD-L1表达,不影响其迁移,其作用机制可能是通过促进细胞内PD-L1、p-ERK和p-AKT表达实现的。