牛支原体脂质相关膜蛋白GLCP抑制宿主EBL细胞凋亡的分子机制研究

为探究牛支原体(M.bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)抑制宿主细胞凋亡的分子机制,本研究利用实验室前期经AKTA分子筛分成5组的M.bovis TJ株LAMPs分别刺激胎牛肺(EBL)细胞,经western blot检测各组LAMPs对EBL细胞中凋亡执行分子Caspase-3剪切激活水平的影响,经CCK-8试验检测筛选出的目标LAMPs对EBL细胞活力的影响,并对其进行蛋白质谱测序分析。结果显示,D组LAMPs能够抑制Caspase-3的剪切激活水平,并可以极显著提高EBL细胞活力,结合蛋白质谱测序结果以及生物信息学软件预测蛋白功能,选定VSPHB0801-4、TPP、DJ-1、EF-TU、GAPDH以及GLCP为候选蛋白进行后续试验。经PCR扩增dj-1基因,重叠延伸PCR扩增ef-tu和glcp融合基因,vsphb0801-4、tpp和gapdh基因片段则由华大基因公司合成,将上述基因片段分别克隆至相应的原核表达载体中,构建重组质粒pET-28a-vsphb0801-4、pET-28a-tpp、pET-32a-dj-1、pET-32a-ef-tu、pEGX-6P-1-gapdh和pMAL-c5X-glcp,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后通过亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测重组蛋白的纯化效果。结果显示,获得了纯度较高的6个重组蛋白。将不同浓度的6个重组蛋白分别刺激EBL细胞,经western blot验证重组蛋白是否具有抑制EBL细胞凋亡的作用,结果显示,只有重组蛋白GLCP能够抑制EBL细胞凋亡。因此,将其作为靶标蛋白进一步探究其抑制EBL细胞凋亡的分子机制。将不同浓度的重组蛋白GLCP分别刺激EBL细胞后,经western blot检测经典凋亡通路介导分子Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的剪切激活水平、激光共聚焦显微镜检测EBL细胞线粒体膜电位,以及western blot检测线粒体介导的凋亡通路关键分子Bcl-2、Bax、Cyt C、Apaf-1以及剪切的多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP1)蛋白的表达水平。结果显示,重组蛋白GLCP主要抑制Caspase-9的剪切激活水平,提高线粒体膜电位,并上调线粒体介导的凋亡通路关键分子Bcl-2蛋白的表达水平,以及下调Bax、Cyt C、Apaf-1和剪切的PARP1蛋白表达水平。以上实验结果表明,重组蛋白GLCP主要通过线粒体介导的凋亡通路抑制EBL细胞凋亡。本研究首次筛选到抑制EBL细胞凋亡的M.bovis脂质相关膜蛋白GLCP,并初步解析了其抑制宿主细胞凋亡的分子机制,为M.bovis持续性感染机制的研究提供参考依据。

珠子参皂苷通过激活 PI3K/Akt通路对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

目的:研究珠子参皂苷对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法:雄性昆明小鼠随机分为假手术组、模型组、珠子参皂苷(100 mg/kg)、珠子参皂苷(200 mg/kg)和尼莫地平组(2 mg/kg)。给药组灌胃给予相应的药物,假手术组和模型组灌胃给予同体积 0.5%羧甲基纤维素钠溶液,每天1次,连续7 d。以上各组给药7 d后制作小鼠大脑中动脉闭塞模型,假手术组切开缝合不进行动脉阻塞,在缺血2 h再灌注24 h后进行神经功能缺损评分、脑水肿、梗死面积和脑组织形态学分析,血液中ROS、LDH、SOD、GSH-Px、CAT和MDA的水平检测,Western blot检测脑组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax、Cytochrome C、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3蛋白表达。结果:珠子参皂苷(100和200 mg/kg)和尼莫地平(2 mg/kg)可显著改善脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能缺损评分、脑水肿、梗死面积和脑组织形态学,降低血清ROS、LDH和MDA水平,升高SOD、GSH-Px、CAT活性,上调脑组织中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达和升高Bcl-2/Bax比率,下调Bax、Cytochrome C、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3蛋白表达。结论:珠子参皂苷对小鼠缺血再灌注损伤具有较好的保护作用,其作用机制可能与其激活PI3K/Akt通路和抑制线粒体介导的凋亡通路有关。