一种基于线粒体分离纯化技术的新型线粒体DNA深度测序方法

目的 开发并评估一种基于线粒体分离纯化技术的线粒体DNA(mtDNA)深度测序方法。方法 探索从细胞中分离mtDNA的最适条件;基于该方法对外周血单个核细胞(PBMC)样本进行mtDNA深度测序,通过测序片段(reads)中mtDNA reads占比评估测序文库中mtDNA的纯度,通过Sanger测序验证该方法所检出的mtDNA变异的准确性。结果 采用含低浓度NP40和不含Tween-20的裂解液裂解细胞获得的mtDNA纯度高,几乎不含细胞核基因组。在6例PBMC样本中应用该方法检测结果显示,mtDNA reads占比为87.8%~92.8%,且检测出多个mtDNA变异。对其中1个异质性变异和3个同质性变异进行Sanger测序验证,二者结果相一致。结论 本研究开发的基于线粒体分离纯化技术的mtDNA深度测序方法可应用于PBMC样本,能准确且灵敏地检出线粒体基因组的同质性和异质性变异。

针对微量细胞样本进行细胞核和线粒体基因组同步快速分离的方法研究

开发了一种针对微量细胞样本进行细胞核和线粒体基因组同步快速分离的方法。该方法首先利用体积分数1%非离子型表面活性剂NP-40能够选择性破坏细胞膜而维持细胞核完整性的特征,实现了细胞的轻柔裂解和细胞核完整性的维持;其次通过差速离心,实现细胞核(核基因组)与线粒体基因组的同步分离。经过显微成像观察,核酸蛋白分析仪检测以及PCR分析,实现了从10^(2)到10^(6)个悬浮培养细胞中高质量线粒体基因组的分离纯化。本方法获取的线粒体基因组无核基因组污染,为后续开展线粒体群体遗传分析、线粒体疾病诊断提供了一种高效、快速、低成本的解决方案。

一种新型线粒体DNA深度测序方法的准确性评估

目的 与基于长片段PCR(lrPCR)的传统mtDNA测序方法比较,评估本课题组前期研究开发的一种新型非PCR依赖的mtDNA深度测序方法的可靠性。方法 同时采用新方法和传统方法对10例产前筛查孕妇外周血样本进行平行试验,对比两种方法所得结果,结合人群数据库(MitoMAP和mtDB)信息,评估新方法的准确性。结果 10例样本中共检出380个变异,其中351个变异同时被两种方法检出,29个变异仅被单一方法检出。对29个不一致变异中出现于2个或2个以上样本的8个变异进一步分析发现,2个仅被新方法重复检出的变异在人群数据库中存在记录;而6个仅传统方法重复检出的变异在人群数据库中未见记录。结论 与传统基于lrPCR的mtDNA测序方法相比,新方法针对同质性变异及高异质度变异的检测能力相当,而针对低异质度变异检测时具有更高的准确性。