尖孢镰刀菌粘团专化型线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因敲除突变体的构建与表型分析

【目的】研究线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因在尖孢镰刀菌粘团专化型中的功能。【方法】利用同源重组原理,采用PEG介导原生质体的转化方法获得基因敲除突变体,并分析其表型和致病力。【结果】敲除Tom7基因导致尖孢镰刀菌的生长速率减慢,菌丝出现波浪状弯曲生长,产孢量增加,对氧胁迫和渗透胁迫敏感,但对其毒力无影响。【结论】由此推测线粒体外膜转运酶亚基Tom7基因缺失后,影响线粒体蛋白转运功能,进一步对尖孢镰刀菌的生长发育和产孢造成影响。

日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

目的克隆、表达日本血吸虫线粒体外膜转运酶34基因(SjTOM34),并对其生物特性进行初步研究。方法应用RT-PCR方法从42d日本血吸虫成虫cDNA中扩增SjTOM34基因,并进行生物信息学分析。应用实时定量RT-PCR方法分析了SjTOM34基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达状况。构建了SjTOM34基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,Western blotting分析了重组抗原的免疫原性及该蛋白在不同发育阶段虫体中的表达情况,利用免疫组化方法观察了该蛋白在虫体内的分布情况。结果获得了SjTOM34的基因序列,其开放阅读框(ORF)为1 083bp。该基因在所检测的不同发育阶段童虫和成虫中均有表达,其中在35d虫体中的表达量略高于其他时期的虫体。成功构建了重组的原核表达质粒并且在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在,并且具有较好的免疫原性,在所检测的各时期虫体中均可检测到该蛋白的存在,并且主要分布在虫体的实质组织中。结论获得了日本血吸虫SjTOM34基因,初步明确了该基因在日本血吸虫童虫和成虫中的表达情况,及在成虫中的分布。

Tom70/PNPT1线粒体转位调控在大鼠心肌细胞缺氧性损伤中的作用及其机制

目的探讨线粒体外膜转位酶70(Tom70)/多核糖核苷酸核苷转移酶1(PNPT1)线粒体转位调控在大鼠心肌细胞缺氧性损伤中的作用及其机制。方法(1)将大鼠H9C2心肌细胞分为对照组(常氧条件培养12h)与缺氧组(缺氧干预12h),采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,qPCR检测TUBA mRNA表达情况,Western blotting检测PNPT1蛋白表达情况。(2)利用携带Tom70序列的慢病毒载体转染H9C2细胞,分为NC组(慢病毒阴性对照组,转染慢病毒空载体)、Tom70过表达组(转染携带Tom70序列的慢病毒载体)、缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组,采用Western blotting检测各组Tom70、PNPT1蛋白表达水平,采用流式细胞术检测缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组细胞凋亡率,qPCR检测缺氧+NC组、缺氧+Tom70过表达组TUBA mRNA表达情况,免疫共沉淀技术检测细胞中Tom70与PNPT1的相互作用情况。结果(1)流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,缺氧组细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。qPCR检测结果显示,与对照组比较,缺氧组细胞中TUBA mRNA含量明显减少(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与对照组比较,缺氧组线粒体内PNPT1蛋白表达水平明显降低,而胞质PNPT1蛋白表达水平明显上升(P<0.05)。(2)Western blotting检测结果显示,与对照组和NC组比较,Tom70过表达组细胞内Tom70表达量明显增加(P<0.05);常氧条件下,NC组与Tom70过表达组线粒体及胞质中的PNPT1表达均无明显差异,而缺氧条件下,与缺氧+NC组比较,缺氧+Tom70过表达组线粒体PNPT1表达水平明显升高,胞质PNPT1表达水平明显降低(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示,心肌细胞中的Tom70与PNPT1能够相互结合。流式细胞术检测结果显示,与缺氧+NC组比较,缺氧+Tom70过表达组细胞凋亡率下降(P<0.05)。qPCR检测结果显示,与缺氧+NC组相比,缺氧+Tom70过表达组TUBA mRNA表达水平明显增高(P<0.05)。结论Tom70可通过调控PNPT1的线粒体定位表达减少凋亡相关mRNA的降解来减轻大鼠心肌细胞缺氧性损伤。

Tomm34在卵巢癌中的表达及其与癌症分期的关系

目的研究线粒体外膜转运子34(Tomm34)在卵巢癌组织中的表达,探讨其表达水平与癌症分期的关系。方法收集2016年2月-2018年10月在深圳市南山区人民医院诊断为卵巢癌并接受手术治疗的94例患者资料纳入本次研究。采用免疫组织化学法检测肿瘤中Tomm34的表达情况。比较患者的临床特征和组织学特征与Tomm34表达水平的关系。结果所有样本进行Tomm34 IHC实验后,有11例样品(11.70%)为0分,29例样品(30.85%)为1分,32例样品(34.04%)为2分,22例样品(23.40%)为3分。两种病理分类样本的Tomm34水平比较,1类样品的Tomm34表达评分(1.49±0.92)显著低于2类样品(1.91±0.97),差异具有统计学意义(P<0.05)。与野生型p53基因的样品比较,携带突变型p53基因的卵巢癌样本的Tomm34表达评分显著更高(P<0.05)。不同国际妇产科联合会(FIGO)分期卵巢癌样本的Tomm34表达评分之间的差异具有明显统计学意义(F=2.788,P=0.045),Spearman相关性分析结果显示Tomm34的表达水平与FIGO分期存在一定相关性(r=0.2749,P=0.0073),FIGO分期越高,Tomm34的表达水平越高。Logistic回归分析可得,Tomm34表达水平与CA125水平有显著相关性(r=0.4005,P<0.05),随着CA125水平增高,Tomm34表达水平也越高,即两者之间呈正相关。结论卵巢癌组织中Tomm34表达发生异常,其表达水平与肿瘤类型、分期等有明显相关性。