双定位信号增强工程化蛋白线粒体靶向性呈递

有效传递工程化改造的蛋白进入线粒体对开发高效的线粒体DNA编辑工具、实现线粒体疾病精准治疗具有重要意义。本研究选取eGFP和Cas9基因,在其上游或/和下游引入不同的线粒体定位信号(mitochondrial localization signal,MLS)序列,分别构建了相应的工程化蛋白表达载体。将不同表达载体转染HEK293T细胞后,利用荧光共定位实验和免疫印迹实验分析不同工程化蛋白的线粒体靶向性呈递效果。结果显示,相比单端添加MLS的eGFP和Cas9蛋白,双端MLS改造均显著提高了工程化蛋白的线粒体靶向性呈递效率。推测双MLS策略可增强工程化蛋白的线粒体靶向性,为以后开发高效的线粒体DNA编辑工具奠定了理论基础。

CNP2线粒体定位信号以及磷酸酯酶活性对抑制HIV-1 Gag蛋白组装作用的影响

目的研究CNP2在线粒体上的定位以及磷酸酯酶活性是否参与抑制HIV-1病毒颗粒组装。方法采用RT-PCR扩增野生型CNP2编码区,插入到真核表达载体pc DNA5,构建融合蛋白FlagCNP2的表达质粒pc DNA5-Flag-CNP2。应用融合PCR诱导突变法构建CNP1及CNP2突变表达载体。CNP表达载体分别与HIV-1假病毒包装质粒p LP1、p LP2、p LP/VSVG、p Lenti6-EGFP共同瞬时转染293T细胞。集落形成实验检测上清病毒滴度,Western blot检测细胞中Gag蛋白p55、p24以及细胞培养上清中p24的表达情况。结果与对照组比较,CNP2、CNP1、CNP2-S9/22A可以显著抑制细胞中病毒的释放,培养上清中病毒滴度显著降低(滴度分别为5.66、4.20、5.75、6.63 Log10IU/ml,NC组为7.65 Log10 IU/ml;t=58.23、17.24、12.77、6.131,P=0.0035、0.0066、0.0004、0.0039)。CNP1抑制HIV-1病毒颗粒组装作用更强,Western blot检测培养上清中病毒蛋白完全p24消失。磷酸酯酶结构域(2HM)突变后CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装的作用显著降低。结论 CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装需要磷酸酯酶结构域(2HM)的参与,CNP2的线粒体定位信号可能会影响其抑制HIV病毒颗粒组装的作用。

真核生物DNA连接酶Ⅲ的功能演化

DNA连接酶Ⅲ被认为只存在于脊椎动物,并在细胞核DNA的修复和线粒体DNA的复制和修复过程中发挥功能.虽然近来有关于无脊椎动物中存在着DNA连接酶Ⅲ的报道,但其功能演化及在无脊椎动物中的分布仍不清楚.为进一步探讨DNA连接酶Ⅲ的功能演化,进行了数据库搜索、线粒体定位信号(MLS)预测和功能位点保守性分析等.研究结果显示:DNA连接酶Ⅲ在变形虫、动物界和领鞭毛虫中广泛存在,但其在真菌界等发生整个蛋白或部分结构域的丢失;很多物种的DNA连接酶Ⅲ不含线粒体定位信号,因此,它们不太可能在线粒体中发挥作用,而参与细胞核DNA的修复是DNA连接酶Ⅲ较为古老和保守的功能.

NADH扰动对酿酒酵母葡萄糖效应的影响

利用不同拷贝数的载体在酿酒酵母中表达还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶(NOX)和可替代氧化酶(AOX1),并通过线粒体定位信号减少AOX1对胞质NADH的影响,从而考察NOX和AOX1在分批发酵中对酿酒酵母葡萄糖效应的作用及其对葡萄糖生产衣康酸的影响。结果表明,高拷贝载体表达nox、aox1基因的菌株均有明显的代谢变化,高拷贝表达nox菌株能够氧化胞质NADH,培养基中甘油分泌减少43.94%,衣康酸生产不受影响。而高拷贝表达aox1的菌株存在胞质残留AOX1,会氧化胞质NADH而减少甘油积累。利用线粒体定位信号AAC2和BCS1p将AOX1进一步定位至酿酒酵母线粒体,120 h时衣康酸产量增加至116.98 mg/L。但是AOX1、AAC2-AOX1和BCS1p-AOX1表达菌株都没有明显减少分批发酵中乙醇的积累。在高糖培养基中进行分批发酵,NOX能够减少葡萄糖效应甘油的积累,而AOX1、AAC2-AOX1和BCS1p-AOX1不能减少葡萄糖效应副产物乙醇的积累。

靶向定位的乙型肝炎病毒X蛋白真核表达载体构建及表达

目的构建带有核定位信号(NLS)和线粒体定位信号(MLS)的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)真核表达载体,并检测其在人胚肾293FT细胞中的表达和亚细胞定位情况。方法采用PCR技术分别扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx序列,人工合成编码NLS和MLS的核酸序列,依次将其克隆至pcDNA4.0载体中。将重组质粒转染293FT细胞,Western blot检测融合蛋白的表达情况,荧光显微镜观察带有定位标签的HBx在细胞中的定位。结果测序鉴定结果表明带有NLS、MLS和EGFP标签的HBx真核表达载体构建成功,转染293FT细胞能够正常表达融合蛋白,在荧光显微镜下,NLS和MLS能够将EGFP-HBx融合蛋白分别定位于细胞核和线粒体。结论本研究构建的能够特异性靶向HBx蛋白至细胞核和线粒体的真核表达载体,能够在哺乳动物细胞293FT细胞中表达,为进一步深入研究不同定位HBx的生物学功能奠定了基础。