香蕉枯萎病菌线粒体小亚基(mtSSU)rDNA的克隆及序列分析

为探讨镰刀菌属的系统发育情况,采用真核生物线粒体中核糖体小亚基基因(mtSSU rDNA)的通用引物,PCR扩增了2株不同生理小种(小种4和小种1)的香蕉枯萎病菌mtSSU rDNA序列,并对PCR产物进行了序列分析,同时利用MEGA4软件中的Neighbor-joining(N-J)法,对2个样品序列以及GenBank中登陆的镰刀菌属不同种及尖镰孢种不同专化型的mtSSU rDNA序列,构建聚类分析树状图。结果显示,所测的2株香蕉枯萎病菌mtSSU rDNA全长685bp,两者之间同源性为99.70%。聚类分析表明,所测的2个样品和Fusarium oxysporumf.sp.cubense专化型在一个聚类组中,镰刀菌不同种及同种不同专化型间的mtSSU rDNA序列变异较大,说明该菌不同种及同种不同专化型间的遗传多样性丰富。

抗人线粒体核糖体小亚基蛋白17单克隆抗体的制备和鉴定

以纯化人线粒体核糖体小亚基蛋白17(MRPS17)免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和ELISA法筛选成功获得1株抗MRPS17杂交瘤细胞。以所获特异性单抗作为一抗,使用Western印迹、免疫组化和免疫荧光等方法检测标本中MRPS17。结果显示:Western印迹检测人骨骼肌组织、黑素瘤组织和体外培养HeLa细胞提取蛋白质,在分子量约13kDa处有一特异性条带,与阳性对照纯化MRPS17相一致;免疫组化检测石蜡切片标本显示人骨骼肌细胞和恶性黑素瘤细胞胞浆中强阳性着色;细胞免疫荧光检测于培养的HeLa细胞,可见细胞核周围胞浆部位颗粒状绿色荧光,其分布与线粒体特异性荧光探针(MitoTrackerRedCM-H2XRos)的荧光分布一致。说明成功制备了具有高度特异性并可适用于多种检测方法的抗人MRPS17单抗,应用该单克隆抗体对人MRPS17进行了亚细胞水平定位,为线粒体生物学相关研究提供了新的研究工具。

基于线粒体序列特征的茶树菇及杨柳田头菇分离物快速鉴定

为探寻特异的DNA序列,快速鉴定茶树菇(Agrocybe aegerita)及其形态上易混淆种,给种质资源收集及利用提供有效工具。以云南采集到的18个菌株为材料,其中5株为A.aegerita,13个为A.salicacola,并对线粒体小亚基V9区进行序列分析。结果发现A.aegerita比A.salicacola多1个约50碱基的插入片段,而其他序列组成一致。根据此特点,在插入区筛选到1个特异DraⅠ酶切位点。通过对18个菌株V9区PCR产物进行酶切,发现A.aegeritaV9片段能完全被切开,而A.salicacolaV9片段则为完整。根据此酶切方法,可以高效鉴定A.aegerita及A.salicacola2个近似种,为食用菌遗传及育种研究提供了重要的基础。

一株产凝乳酶变色栓菌鉴定及其凝乳酶的分离纯化与酶学性质研究

微生物凝乳酶具有生产周期短和易于发酵生产的优点,是传统小牛皱胃酶的经济高效替代选择之一。为了筛选新的凝乳酶产生菌,该研究以从传统发酵腐乳分离的霉菌为出发菌株,筛选具有高凝乳活性和低蛋白水解活性的霉菌菌株。采用内源转录区间隔区结合线粒体小亚基核糖体DNA扩增测序的方法对菌株进行了分子鉴定。通过硫酸铵分级盐析沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱、Sephadex G100凝胶过滤层析法对酶进行了纯化,并研究了凝乳酶酶学特性。筛选出菌株CQ3具有良好的凝乳活性和低蛋白水解活性,该菌株鉴定为变色栓菌(Trametes versicolor)。CQ3凝乳酶纯化后经SDS-PAGE分析呈现出分子质量为61 kDa的唯一条带。该酶作用的最适温度为45℃,最适pH值为6.5,Ca^(2+)对酶活力有显著的促进作用。该酶在pH值为4.5~7.0和温度低于50℃条件下有良好的稳定性。蛋白酶抑制剂试验表明,该酶为一种天冬氨酸蛋白酶。该研究结果报道了一种新的产凝乳酶菌种资源,为丰富凝乳酶产生菌株资源,进一步评价栓菌凝乳酶在干酪加工适用性的研究提供了理论基础。

茶树菇复合群系统类群及交配分析

茶树菇复合群是一类具有重要经济价值的菌类,其菌株资源多样,命名混乱。为给育种工作提供参考依据,利用线粒体小亚基V4-6-9区序列和交配,对4个代表菌株进行分子和交配特征分析。结果表明:(1)线粒体小亚基序列作为类群区分的有效标记,有效区分杨柳田头菇类群、茶树菇/茶薪菇类群和杨树菇类群;(2)交配特征显示杨柳田头菇为独立生物学种,而其他类群属同一生物学种,建议使用茶树菇这一名称。研究结果可为茶树菇资源鉴定及育种研究提供参考。