钙黏蛋白家族成员3及11号染色体开放阅读框30基因多态性与支气管哮喘病儿易感性及糖皮质激素疗效的研究

目的探讨钙黏蛋白家族成员3(CDHR3)及11号染色体开放阅读框30(C11orf30,EMSY)基因多态性与支气管哮喘病儿易感性及糖皮质激素疗效。方法前瞻性选取2020年5月至2021年10月于泰州市第二人民医院就诊的支气管哮喘病儿132例作为易感组。均接受糖皮质激素吸入治疗,并根据疗效分为疗效良好组和疗效不良组。选取同期体检的48例儿童作为对照组,采用倾向性匹配方法对易感组和对照组性别、年龄等基线资料进行匹配;采用PCR检测CDHR3及EMSY基因的单核苷酸多态性,计算其基因型频率和等位基因频率,基因位点的多态性与儿童支气管哮喘易感风险间的关系采用多因素logistic回归分析。对比疗效良好组和疗效不良组不同基因型分布。结果易感组和对照组经倾向性评分匹配后有36组配对成功(每组36例),匹配后基线资料对比差异无统计学意义(P>0.05)。匹配后易感组和对照组CDHR3基因rs6967330位点、EMSY基因rs12278256位点基因型频率及A等位基因频率比较差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示:EMSY基因rs12278256位点AA基因型[OR=9.91,95%CI:(1.02,96.65)]、CDHR3基因rs6967330位点AA基因型[OR=10.09,95%CI:(1.08,94.02)]是支气管哮喘易感的危险因素(均P<0.05)。治疗12周后,24例(66.67%)为疗效良好组,其余12例(33.33%)归为疗效不佳组,两组CDHR3基因rs6967330位点基因型分布对比差异无统计学意义(P>0.05);两组EMSY基因rs12278256位点基因型分布对比差异有统计学意义(P<0.05),其中疗效良好组AA基因型分布频率[37.50%(9/24)]明显高于疗效不良组[0(0/12)](P<0.05)。结论CDHR3基因rs3847076位点以及EMSY基因rs12278256位点与儿童支气管哮喘易感有关,EMSY基因rs12278256位点与糖皮质激素治疗疗效相关。

鸡PPARγ基因转录本5的两个上游开放阅读框功能分析

前期研究发现,鸡PPARγ基因转录本5(c PPARγ5)的5’非翻译区(5’untranslated region,5’UTR)存在两个上游开放阅读框(uORF1和uORF2)。为揭示这两个uORFs在鸡PPARγ基因表达转录后调控作用,试验使用报告基因、定点突变、q RT-PCR和Western blot等技术,分析两个uORFs对报告基因活性及PPARγmRNA和蛋白表达的影响。结果表明,与野生型相比,uORF1和uORF2分别突变和同时突变均显著促进报告基因活性及PPARγm RNA和蛋白表达(P<0.05)。mRNA稳定性分析发现,两个uORFs突变对报告基因mRNA稳定性无显著影响。启动子活性分析发现,c PPARγ的5’UTR区具有启动子活性。研究结果表明,cPPARγ5的两个u ORFs抑制其翻译。

棉花CMS-D2和CMS-D8不育系线粒体全基因组比较分析

【目的】探究哈克尼西棉不育胞质(CMS-D2)和三裂棉不育胞质(CMS-D8)的不育系线粒体基因组之间的序列结构差异,为筛选鉴定不育相关基因奠定基础。【方法】根据D2A和D8A这2个不育系的线粒体基因组测序组装结果,使用Synteny and Rearrangement Identifier(Sy RI)软件鉴定结构变异,用Plotsr可视化分析包含共线性及非共线性区域的重组变异位点。以D8A线粒体基因组注释结果为参考,用D2A线粒体基因组注释的开放阅读框(open reading frame,ORF)编码的氨基酸序列进行tblastn比对,筛选出D2A线粒体基因组中特有的ORF,并进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证、相对表达量分析和生物信息学分析。【结果】D2A和D8A这2个不育系线粒体基因组之间存在2个部分重叠且相邻的倒易位区域。在D2A中发现17个特异的ORF,PCR验证了D2A中存在的6个特异ORF(orf114e、orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2、orf186a-2和orf317a-2)。3~4 mm花蕾中orf121b-1和orf121b-2的相对表达量较高。orf114e、orf186a-2和orf317a-2具有典型的跨膜结构域和嵌合基因结构,符合不育基因的部分特征。【结论】D2A和D8A线粒体基因组间存在2个相邻的倒易位区域。D2A中存在6个特异的ORF,其中orf114e、orf186a-2和orf317a-2可能与棉花CMS-D2孢子体败育有关。

植物CMS线粒体相关开放阅读框(ORFs)研究进展

从DNA、RNA、蛋白质水平分别阐述了线粒体开放阅读框(ORFs)与胞质雄性不育(CMS)的关系,并对目前发掘与胞质雄性不育相关的线粒体基因的研究策略进行了探讨。

RT－PCR联合一步法扩增G蛋白α亚基基因的开放阅读框

报道逆转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）联合一步程序，扩增大于１ｋｂ的拟南芥菜Ｇ蛋白α亚基基因的开放阅读框。该程序中，当ＲＮＡ模板和引物变性，并在同一管中加入ＰＣＲ缓冲液、４种ｄＮＴＰ底物、逆转录酶和ＴａｑＤＮＡ聚合酶之后，就不需其它手工操作步骤，因而可同时进行大批量样品的操作。实验结果证明ＡＭＶ（鸟类骨髓性白血病病毒）逆转录酶对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的活性没有抑制作用。这种ＲＴ－ＰＣＲ联合一步法可从０．５μｇ的总ＲＮＡ中快速地扩增长于１．０ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。

鸡PPARγ基因转录本3上游开放阅读框转录后的调控作用

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是脂肪生成的关键调控因子。本实验室前期研究发现,与人和鼠等哺乳动物PPARγ基因的转录本不同,鸡PPARγ基因的多个转录本5′UTR区存在上游开放阅读框(upstream open reading frames,u ORFs)。为了揭示该u ORF转录后的调控作用,本研究构建了鸡PPARγ基因转录本3(c PPARγ3)野生型5′UTR报告基因载体psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-WT和u ORF突变(u ATG突变为终止密码子TGA)的5′UTR报告基因载体psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-Mut。将这两个报告基因载体分别转染永生化鸡前脂肪细胞(immortalized chicken pre-adipocytes,ICPA)和鸡胚成纤维细胞DF1,检测海肾荧光素酶报告基因h Rluc活性及其m RNA表达。荧光素酶报告基因检测结果显示,在ICPA细胞中,psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-Mut的h Rluc报告基因活性极显著高于psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-WT(P<0.01);在DF1细胞中,psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-Mut的h Rluc报告基因活性高于psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-WT,但差异不显著(P>0.05)。q RT-PCR检测h Rluc基因m RNA表达结果显示,与psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-WT相比,在ICPA细胞中,psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞的h Rluc基因的m RNA表达水平极显著降低(P<0.01);在DF1细胞中,psi CHECK2-c PPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞后,h Rluc基因的m RNA表达水平也降低,但差异不显著(P>0.05)。为进一步分析该u ORF对鸡c PPARγ3的转录后调控作用,本研究又分别构建了野生型c PPARγ3真核表达载体pc DNA3.1-c PPARγ3-WT和u ORF突变的c PPARγ3真核表达载体pc DNA3.1-c PPARγ3-Mut。q RT-PCR检测c PPARγ3的m RNA表达水平,结果显示,在这两种细胞中,pc DNA3.1-c PPARγ3-Mut转染细胞的c PPARγ3 m RNA表达水平均显著低于pc DNA3.1-c PPARγ3-WT转染细胞(P<0.05),但Western blot结果显示,pc DNA3.1-c PPARγ3-Mut转染细胞的PPARγ蛋白表达水平极显著高于pc DNA3.1-c PPARγ3-WT转染细胞(P<0.01)。这些研究结果表明,5′UTR区的u ORF抑制鸡c PPARγ3的翻译。

含全长开放阅读框的HLA—DRB4＊01030101基因cDNA的克隆

目的构建含有HLA-DRA和DRB4*01030101基因全长开放阅读框的cDNA克隆载体。方法用RT-PCR方法从人外周血白细胞中获得HLA-DRA和DRB4*01030101的全长编码基因,分别克隆至pMD18-T载体,并进行序列测定和比对分析。结果从人外周血白细胞中扩增出HLA-DRA和DRB4*01030101含全长开放阅读框的cDNA,分别克隆至pMD18-T载体,经序列测定和比对分析证实,HLA-DRA和DRB4*01030101编码基因与文献报道序列完全一致,阅读框与设计相符。结论成功构建了含有HLA-DRA和DRB4*01030101基因全长开放阅读框的cDNA克隆载体,为体外表达HLA-DRB4抗原分子及研究其分子间相互作用奠定了实验基础。

基于新一代测序技术精准确定复制缺陷型痘苗病毒天坛株全基因组序列及其开放阅读框组成

目的应用新一代长读长测序技术精准确定复制缺陷型痘苗病毒天坛株(non-replicating Tiantan strain of vaccinia virus,NTV)全基因组序列及其开放阅读框(ORFs)组成。方法基于本实验室储备的NTV,在鸡胚成纤维细胞上进行扩增并纯化,提取NTV全长基因组核酸。PacBio HiFi测序从头组装获取NTV全长基因组序列。以同源注释的策略确定其ORF组成,并分析其与已知复制缺陷型痘苗病毒毒株ORF异同。结果NTV全长共171729 bp,GC含量为33%,其独特的倒置末端重复(ITR)区域包含发夹结构、两个串联重复区域及3个非重复区域。NTV共有166个ORFs,与第三代天花病毒疫苗改良安卡拉株(MVA-BN)和复制缺陷型哥本哈根株(NYVAC)株相比,主要差异位于ITR及其周围区域,3个毒株共同享有138个ORFs,NTV特有6个编码与病毒逃避宿主抗病毒反应相关的ORFs。结论通过三代测序技术精准确定NTV全基因组序列及ORFs组成,并揭示其与其他复制缺陷型痘苗病毒毒株的异同,为新一代猴痘疫苗和痘苗病毒载体研发应用提供重要参考。

线粒体衍生肽MOTS-c在代谢及衰老相关疾病中的研究进展

线粒体衍生肽是由线粒体DNA编码的一系列肽,具有与线粒体相似的功能。线粒体开放阅读框12S rRNA-c(MOST-c)是线粒体12S rRNA短开放阅读框编码的一种由16个氨基酸组成的多肽,与线粒体DNA基因组同源,其在压力应激等的作用下在细胞核内发挥细胞功能甚至类似激素作用。MOTS-c与线粒体共定位,在骨骼肌、睾丸、心脏等器官组织中表达,啮齿类动物和人类血浆中均可检测到。MOTS-c通过抑制细胞内叶酸循环和嘌呤核苷酸生物从头合成,激活AMP活化的蛋白激酶,发挥调节代谢、抗衰老、抗炎、镇痛等作用,有望成为代谢及衰老相关疾病新的治疗靶点。

4型禽腺病毒分离株SDLC202011的致病性及全基因组序列分析

为了掌握4型禽腺病毒(FAdV-4)山东聊城分离株SDLC202011的致病特点及遗传变异情况,对其进行了致病性试验和全基因测序分析。结果表明:该分离株对21日龄SPF鸡的致死率为100%,感染鸡的心脏、肝脏、肾脏等器官均具有典型的病理变化,免疫组化显示肝脏、胰腺和肾脏中均检测到该病毒的抗原;全基因组序列长度为43826 bp,编码34个开放阅读框。与国外参考毒株相比,该毒株和国内其他毒株在35473~37439 bp均有1966 bp的缺失,该区域包含ORF19、ORF48和ORF27;与非致病性毒株相比,高致病力毒株在hexon、fiber1和fiber2分别有1、3和12个氨基酸位点突变,突变主要集中在fiber2。本研究结果表明分离株SDLC202011为高致病力毒株,可在肝脏、胰腺和肾脏等脏器中增殖,为进一步研究FAdV-4的致病机制及疫苗研发奠定了基础。

白三叶类黄酮合成基因TrCHI的克隆及转录分析

为研究白三叶类黄酮合成途径的关键基因TrCHI在白三叶(Trifolium repens)花色形成中的作用,以白三叶野生型和红花突变体为材料,通过同源克隆得到TrCHI基因并进行转录分析和CHI酶活性测定。结果表明,白三叶野生型TrCHI基因开放阅读框长660 bp,编码219个氨基酸,其红花突变体TrCHI开放阅读框长度为669 bp,编码222个氨基酸。7处氨基酸突变包括:第13号位的谷氨酸突变成天冬氨酸,第75号位的谷氨酸突变成谷氨酰胺,第154号位的丝氨酸突变成苏氨酸,第218号位的赖氨酸突变成精氨酸,并在末尾增加了甘氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。进化分析发现,CHI基因进化具有物种保守性,Tr CHI属于Ⅱ型CHI。花瓣、根和叶柄中,红花突变体TrCHI转录水平显著高于野生型;但在茎、叶和花梗中,红花突变体TrCHI基因转录水平低于野生型。突变体花瓣中CHI酶活性极显著高于野生型(P<0.001)。推测白三叶突变体的红花表型与TrCHI基因突变并对白三叶中的类黄酮化合物的合成调控有关。本研究为进一步研究TrCHI在白三叶上的潜在功能提供了一定的价值。

植物细胞质雄性不育与线粒体

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)是由于核基因组与细胞质基因组之间不协调互作导致的一种雄性器官异常而雌器官可以接受外来花粉正常结实的自然现象。在生产上,CMS是植物杂交制种的有力工具和杂种优势利用的重要途径。对CMS分子机制的解析是其有效利用的基础,一直以来都是研究的热点,然而其机制研究却相对滞后。该文从线粒体嵌合基因(orfs)形成、特征及分类,基因转录后修饰(RNA编辑)的特点及与CMS的关系,基因翻译产物特征、分类及其与CMS的关系等3个方面综述了近年来植物胞质雄性不育的机制研究进展,以期为进一步深入解析其分子机制提供理论参考。

人类抗砷相关基因hARRG cDNA抗砷功能的研究

目的探讨人类抗砷相关基因hARRGcDNA对砷化物的抵抗作用。方法将人类抗砷相关基因hARRGcDNA基因开放阅读框克隆于真核表达载体pcDNA4/HisC中。通过磷酸钙共沉淀方法将带hARRGcDNA基因开放阅读框的表达质粒与空pcDNA4/HisC质粒分别转染到人正常肝L鄄02细胞中,细胞分别用2、4、6、8、10μmol/LNaAsO2染毒,根据染砷细胞存活数确定hARRGcDNA的抗砷性。结果生物信息学分析hARRG蛋白为膜外蛋白,转染含hARRGcDNA基因开放阅读框的pcDNA4/HisC质粒在砷环境中细胞存活数目多于未带hARRG基因开放阅读框的空质粒。结论hARRGcDNA基因具有一定的抗砷作用。

怀地黄基因片段及其中转座酶基因的克隆与序列分析

根据已知裂叶牵牛花PNZIP启动子碱基序列的相关信息设计引物,采用PCR方法,从怀地黄基因组中扩增出5个基因片段,回收和克隆出其中一个1 096bp的基因片段。经过NCBI对比分析,发现它是一个类似转座子的相关蛋白基因序列,含有一个完整的开放阅读框,大小为450bp,编码由150个氨基酸组成的转座酶。然后,基于该开放阅读框的碱基序列,设计另一对引物,用PCR方法,从中扩增出该完整开放阅读框的序列片段。

小麦抗叶锈病基因Lr45的AFLP分子标记

利用AFLP技术对小麦抗叶锈基因Lr45进行了标记,从60对AFLP引物中筛选出2对在亲本及TcLr45×ThatcherF2抗感群体间揭示多态性的引物P-AGG/M-GAG和P-ACA/M-GGT。其扩增片段为261bp和105bp,2个标记与Lr45的遗传距离分别为0.6cM和1.3cM。测序比较261bp片段与大麦属VulgareHotrI基因部分序列同源性达86%,105bp片段与一粒小麦磷脂酰丝氨酸脱羧酶基因部分序列同源性高达96%。2个测序片段均包含开放阅读框(ORF)序列。

烟青虫气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I(GOBP1)和性信息素结合蛋白(PBP)基因的cDNA序列,设计了2对引物,以烟青虫Helicoverpaassulta触角cDNA为模板,分别进行PCR扩增,获得2条特异性条带,约400bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上,获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明,Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp,编码147个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为17.2kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405bp,编码135个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.1kD和5.2。Hass-GOBP1和Hass-PBP具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基,呈酸性。这2个基因已在GenBank中登记,序列号分别是AY864774和AY864775。

雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMARTcDNA合成和RACE PCR技术 ,克隆得到雌核发育银鲫 (Carassiusauratusgibelio) 4种孵化酶基因的全长cDNA。 4种孵化酶基因分别被命名为GHE1、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明 ,4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为 795bp ,都编码 2 6 5个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在 79 6～95 1 %之间。种系分析表明 ,GHE1、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguillajaponica)孵化酶和青 (Oryziaslatipes)孵化酶之间。不同发育时期胚胎的RT PCR分析表明 ,银鲫GHE1、GHE2、GHE3、GHE4 4种孵化酶基因从尾芽期到幼苗期都检测到表达 ,且GHE3和GHE4在神经胚期也检测到表达。各种组织的RT PCR表明 。

基因表达式编程ORF过滤算子的设计和实现

基因表达式编程(GEP)的个体代表了问题的候选解。在缺乏先验知识的情况下,个体长度的设定是个"两难"问题,过长或过短都会降低GEP的效率。对此,分析了个体长度对GEP求解效率的影响;设计了开放阅读框(ORF)过滤算子根据最优个体的进化历程动态调节个体的有效编码区域;验证了ORF过滤算子的有效性,实验结果表明,在同样的进化代数内,引入ORF过滤算子,GEP能进化出更高适应度的最优解且减少平均运行时间17.0%。

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列。基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9kD,等电点为8.02。此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因。其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白)。

植物CMS不育基因的研究进展

植物细胞质雄性不育是指植物的生殖器官不能产生雄配子,而雌器官发育正常,可接受外来花粉正常结实的一种生物学现象。细胞质雄性不育是由核基因和线粒体基因互作共同起作用,影响了植物花药的绒毡层和正在进行减数分裂的细胞,从而导致植物体花粉产生败育。在生产上细胞质雄性不育对于作物杂种优势的利用、杂交种的制种都有重要意义。雄性不育现象无论是在遗传方向还是分子水平上一直以来都是科学家们研究的热点,深入研究细胞质雄性不育的机制有利于更有效地在生产上加以利用。对近年来植物细胞质雄性不育中发现的细胞质雄性不育基因的来源及分类、细胞质雄性不育与杂种优的相互关系、细胞质雄性不育的机理及目前发现的细胞质雄性不育基因进行概述,并探讨了植物细胞质雄性不育研究的发展前景。