两种巢式PCR法检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的灵敏度评价

目的对ITS1-5.8S rRNA-ITS2巢式PCR法与mtLSUrRNA巢式PCR法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性进行评价。方法把大鼠随机分为7组（6组实验组,1组对照组）,每组10只,采用地塞米松免疫抑制法诱导实验组大鼠感染肺孢子虫;自第3周开始每周剖杀1组实验鼠,收集第3周至第8周实验组大鼠肺组织（LT,lung tissue）和支气管肺泡灌洗液（BALF,bronchoalveolar lavage fluid）标本。同时采用镜检法、ITS1-5.8S rRNA-ITS2巢式PCR法和mtLSUrRNA巢式PCR法对大鼠LT和BALF标本进行检测,并对结果进行统计学分析。结果采用GMS染色镜检法于第5周开始检出肺孢子虫包囊,第6、7周包囊数最多。采用ITS1-5.8S rRNA-ITS2-巢式PCR法和mtLSUrRNA巢式PCR法对实验感染大鼠LT和BALF进行检测,前者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3周20%（2/10）和0（0/10）;第4周70%（7/10）和10%（1/10）;第5周90%（9/10）和30%（3/10）;第6周90%（9/10）和80%（8/10）;第7周100%（10/10）和80%（8/10）;第8周40%（5/8）和40%（5/8）。后者卡氏肺孢子虫阳性率分别为第3周100%（10/10）和100（10/10）;第4周100%（10/10）和80%（8/10）;第5周100%（10/10）和50%（5/10）;第6周90%（9/10）和100%（10/10）;第7周100%（10/10）和80%（8/10）;第8周100%（8/8）和87.5%（7/8）。经？2？检验,在大鼠无明显症状阶段（3~4w）时,两种巢式PCR方法检测敏感性差异有统计学意义。有明显症状阶段（5~8w）时,其敏感性差异无统计学意义;同时统计学分析显示不同来源的标本对不同方法敏感性不同,采用mt-LSU巢式PCR检测时,LT和BALF标本敏感性差异无统计学意义,采用ITS-巢式PCR检测时,对LT检测的敏感性更高。结论 mtLSU-巢式PCR法检测实验大鼠中检出卡氏肺孢子虫敏感性高于ITS1-5.8S rRNA-ITS2-巢式PCR法。

慢病毒介导shRNA特异性干扰MRPL18基因对胰岛素瘤细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体核糖体蛋白大亚基18(mitochondrial ribosomal proteins L18,MRPL18)基因低表达对小鼠胰岛素瘤细胞(MIN6)线粒体能量代谢的影响,该研究利用慢病毒介导的MRPL18 shRNA特异性干扰MRPL18基因,构建MRPL18基因低表达的MIN6细胞模型。Real-time PCR和Western blot检测干扰前后MRPL18 mRNA和蛋白质的表达情况。流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化。海马生物能量代谢仪检测细胞线粒体功能。高效液相色谱检测细胞ATP、ADP和AMP含量。结果显示:转染MRPL18-shRNA后,MRPL18 mRNA和蛋白质表达均显著降低(P<0.05、P<0.01),细胞ROS明显升高(P<0.05);细胞氧耗率、基础呼吸、最大呼吸和储备呼吸能力显著降低,同时ATP产量和质子漏也减少(P<0.05、P<0.01)。细胞ATP含量和能荷较对照组减少,ADP和AMP含量显著增加(P<0.05、P<0.01)。证实了MRPL18基因表达下调后细胞内发生了代谢障碍。推测MRPL18是影响线粒体功能的关键蛋白质,该蛋白在细胞代谢过程中发挥着重要作用。MRPL18表达下降所建立的线粒体功能障碍的MIN6细胞模型,可用于线粒体糖尿病发病分子机制的研究。

mtLSU-巢式PCR检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的实验研究

目的对mtLSU-巢式PCR方法检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值以及基因序列进行评价。方法采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫;实验组10只,对照组1只;诱导至第7周时收集实验组及对照组大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)标本,采用mtLSU-巢式PCR方法对人源与鼠源肺孢子虫共有的基因进行扩增和序列测定,同时采用镜检法对实验组大鼠肺组织和肺泡灌洗液标本进行检测,评估两种方法的敏感性。结果采用mtLSU-巢式PCR方法对实验感染大鼠肺组织和BAL进行检测,卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为100%(10/10)、90%(9/10)。而GMS染色镜检法检测的阳性率分别为80%(8/10)、60%(6/10)。所测Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU基因序列长度为155bp,与GenBank的大鼠源肺孢子虫(U20170)及人源肺孢子虫(DQ473446)同源性均为100%(154/154、155/155)。结论 mtLSU-巢式PCR方法应用于大鼠卡氏肺孢子虫检测敏感性高,特异性强;获得与人源耶氏肺孢子虫相同的Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU的基因序列。

免疫抑制沙鼠源肺孢子菌的分类地位

肺孢子菌能够感染多种哺乳动物的肺脏,并在免疫受抑制的个体引起肺孢子菌肺炎.研究表明,肺孢子菌分离株在系统进化树上分为两大枝,二者所含菌株分别来源于灵长类和啮齿类.基于宿主特异性以及DNA序列和形态学差异,每一分枝内的菌株又可分为不同的种.本研究采用地塞米松免疫抑制法,导致沙鼠(28/35)肺组织感染.对18S,5.8SrRNA和rRNA内转录间隔区基因序列,以及线粒体核糖体大亚基基因的部分序列分析表明,本实验沙鼠源肺孢子菌与啮齿类动物来源的同属一枝,但明显区别于其他啮齿类动物来源的菌株,应考虑是一个独立的菌种.

巢式PCR法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性

目的探讨mtLSU-巢式PCR法检测大鼠卡氏肺孢子虫的敏感性以及应用于早期检测的可行性。方法大鼠随机分为7组(6组实验组,1组对照组),每组10只,采用地塞米松免疫抑制法诱导实验组大鼠感染肺孢子虫;自第三周开始每周剖杀一组实验鼠,收集第三周至第八周实验组大鼠肺组织(LT)和支气管肺泡灌洗液(BAL)标本,同时采用镜检法和mtLSU-巢式PCR法对大鼠肺组织和肺泡灌洗液标本进行检测。结果采用GMS染色镜检法于第五周开始检出肺孢子虫包囊,第六、七周包囊数最多。而采用mtLSU-巢式PCR法对实验感染大鼠LT和BAL进行检测,卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为第三周100%(10/10)、100%(10/10);第四周100%(10/10)、80%(8/10);第五周100%(10/10)、50%(5/10);第六周90%(9/10)、100%(10/10);第七周100%(10/10)、80%(8/10);第八周100%(8/8)、87.5%(7/8)。结论 mtLSU-巢式PCR法可在无症状的实验大鼠中检出卡氏肺孢子虫并且比镜检法早两周,其敏感性明显高于镜检法。