大鼠局灶性脑缺血脑皮质线粒体氯通道基因的表达

目的探讨线粒体氯通道蛋白/CLIC4在局灶性脑缺血损伤中的作用。方法应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。RT-PCR检测脑皮质CLIC4和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达;Western印迹方法检测脑皮质CLIC4的蛋白水平。结果与假手术组相比,缺血模型大脑皮质缺血侧CLIC4及iNOS的mRNA明显增高,CLIC4蛋白水平亦增加,而缺血模型正常侧大脑皮质CLIC4 mRNA及蛋白表达均降低。结论CLIC4可能参与脑缺血引起的神经细胞损伤。

线粒体氯通道蛋白在过氧化氢诱导C6细胞损伤中的作用

目的:利用过氧化氢(H2O2)复制神经胶质瘤C6细胞损伤模型,探讨线粒体氯通道蛋白/CLIC4的变化。方法:应用MTT法检测H2O2作用的C6细胞生存率;紫外分光光度法检测培养液上清LDH释放率;RT-PCR检测CLIC4的mRNA表达;Western blotting方法检测CLIC4的蛋白水平。结果:500μmol/L H2O2作用C6细胞存活率与对照组相比未见明显差异;LDH释放率高于对照组;CLIC4蛋白水平明显强于对照组。而1000μmol/LH2O2作用的C6细胞存活率明显低于对照组;LDH释放率明显高于对照组;CLIC4蛋白水平强于对照组。结论:CLIC4可能参与HO诱导神经胶质瘤细胞损伤的机制。

NPPB和尼弗灭酸对H_2O_2损伤C6胶质细胞谷氨酸半胱氨酸合成酶及CLIC4表达的影响

目的:观察氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)-苯甲酸(NPPB)、尼弗灭酸(NFA)对H2O2诱导的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响。方法:MTT法检测NPPB、NFA、H2O2作用的C6细胞生存率;紫外分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率以及谷胱甘肽GSH水平;RT-PCR检测谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)亚单位GCLC、GCLM及线粒体氯通道(CLIC4)mRNA表达;Western blotting检测CLIC4的蛋白水平。结果:与对照组相比,H2O2组C6细胞存活率和GSH含量明显降低;LDH释放率增加;GCLC、GCLM、CLIC4 mRNA表达降低;CLIC4蛋白水平明显增强。NPPB或NFA与H2O2联合作用于C6细胞组,与单独应用H2O2组相比,细胞存活率和GSH含量未见明显变化;LDH释放率降低;GCLC、GCLM mRNA表达未见明显差异;CLIC4蛋白表达下降。结论:氯通道阻断剂NPPB或NFA能够在一定程度上减轻氧化应激引起的C6细胞损伤,可能与调节细胞膜功能和下调CLIC4蛋白表达有关。

内毒素对过氧化氢引起的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响

目的:观察内毒素(LPS)对过氧化氢(H2O2)诱导的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响,探讨其相关机制。方法:C6细胞按处理方法不同分为空白对照组、100μmol.L-1LPS组、1 000μmol.L-1H2O2组及1 000μmol.L-1H2O2与100μmol.L-1LPS联合应用组。药物作用C6细胞6 h,取培养液上清与细胞沉淀,利用LDH检测试剂盒,采用紫外分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率;原位末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡率;应用RT-PCR检测相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达;Western blotting检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、细胞色素C(Cyt-C)及CLIC4蛋白水平。结果:与空白对照组比较,100μmol.L-1LPS组C6细胞凋亡率及LDH释放率增加(P<0.05),在mRNA水平上Bcl-2、Bax表达率未见明显改变(P>0.05),而Caspase-3表达率升高(P<0.05);在蛋白水平上,与空白对照组比较,Bcl-2、Bax、CLIC4及胞浆Cyt-C蛋白水平未见明显变化(P>0.05),而Caspase-3蛋白水平高于空白对照组(P<0.05)。与空白对照组比较,1 000μmol.L-1H2O2组C6细胞凋亡率及LDH释放率增加(P<0.05);在mRNA水平上Bcl-2表达率低于空白对照组(P<0.05),Bax、Caspase-3表达率高于空白对照组(P<0.05);在蛋白水平上,Bcl-2蛋白表达低于空白对照组(P<0.05),Bax、Caspase-3、CLIC4及胞浆Cyt-C蛋白水平明显高于空白对照组(P<0.05)。与H2O2组和LPS组比较,LPS与H2O2联合作用组细胞凋亡率及LDH释放率明显增加(P<0.05),在mRNA水平上Bcl-2表达率下降(P<0.05),Bax、Caspase-3表达率升高(P<0.05);在蛋白水平上,Bcl-2蛋白表达低于对照组(P<0.05),Bax、Caspase-3及胞浆Cyt-C蛋白水平明显高于对照组(P<0.05),而CLIC4蛋白水平变化不明显(P>0.05)。结论:单独应用LPS能够激活Caspase-3信号通路,引起C6细胞早期凋亡,同时LPS能促进H2O2引起的C6细胞损伤,其机制可能与凋亡相关的Bcl-2/Bax及Caspase-3途径过度激活有关。线粒体氯通道蛋白CLIC4在此过程中作用不明显。

NPPB在大鼠肝细胞分离中的应用效果及其机制

目的观察5-硝基-2(3-苯丙胺)-苯甲酸(NPPB)在大鼠肝细胞分离中的应用效果,并探讨其可能的机制。方法将12只SD大鼠随机分为观察组和对照组各6只。两组分离肝细胞后,采用改良的四步胶原酶分离技术进行消化,制备肝细胞悬液。观察组在使用灌注液进行消化的过程中加入NPPB。采用血细胞计数板计算肝细胞收获量,PAS染色后计算纯度,0.4%台盼蓝染色后计算成活率。细胞无血清培养24 h后,采用全自动生化分析仪检测上层清液中的白蛋白(ALB)、ALT。采用紫外线分光光度法检测LDH吸光度,并计算LDH释放率。采用RT-PCR法检测细胞线粒体氯通道蛋白4(CLIC4)mRNA表达,Western blotting法检测细胞CLIC4蛋白表达。结果观察组与对照组肝细胞收获量分别为(4.41±0.20)×108、(4.40±0.26)×108个,纯度分别为90%±1%、89%±2%,成活率分别为88%±2%、85%±1%;两组比较,P均>0.05。观察组与对照组ALB分别为(43.8±5.0)、(25.2±3.0)g/L,ALT分别为(47.8±6.0)、(104.3±11.7)U/L,LDH释放率分别为21.0%±2.7%、34.0%±2.4%;两组比较,P均<0.05。观察组与对照组CLIC4 mRNA相对表达量分别为1.01±0.02、1.62±0.01,CLIC4蛋白相对表达量分别为0.38±0.02、0.52±0.03;两组比较,P均<0.05。结论肝细胞分离过程中应用NPPB可以在不影响分离细胞收获量、纯度及成活率的情况下,减轻肝细胞膜结构和功能损伤,其机制可能与抑制CLIC4表达有关。

大鼠大脑局部脑缺血周围区海马及大脑皮质CLIC4及14-3-3gamma蛋白的表达及其意义

目的探讨局灶性脑缺血模型中,海马和大脑皮质14-3-3gamma和线粒体氯通道(CLIC4)蛋白的表达。方法通过大脑中动脉阻塞(MCAO)法,应用病理形态学染色发现海马和大脑皮质表现出局灶性脑缺血。应用TTC染色显示大脑缺血区面积。通过Western印迹检测Bax蛋白表达。结果脑缺血周围区海马及大脑皮质组织14-3-3gamma蛋白在神经元细胞质及细胞核呈阳性表达。对照组可见海马及大脑皮质组织CLIC4蛋白在细胞核阳性表达,缺血组可见脑缺血周围区海马及大脑皮质CLIC4蛋白在神经元细胞质呈阳性表达,Bax蛋白表达上调。结论 14-3-3gamma和CLIC4蛋白在脑缺血周围区发挥保护神经元作用。