基于线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)序列的猪和兔四个疥螨分离株的系统发育关系分析

为了探讨兔疥螨分离株和猪疥螨分离株的分类地位,采用PCR技术首次扩增了分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427bp,序列间无插入、缺失,A+T含量(73%)明显高于G+C含量(27%),碱基组成存在明显偏移。猪和兔的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高(99.1%～100.0%),它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%～99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。

桑天牛线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因的PCR反应体系优化

建立一整套适用于研究桑天牛线粒体细胞色素氧化酶I(mtDNA CO I)基因的PCR反应体系,研究不同地理分布的桑天牛遗传多样性。通过L_(16)(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验对缓冲液(Mg^(2+))、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,50μL反应体系及反应程序中各因素优化组合为:缓冲液(含Mg^(2+))0.9mmol/L,dNTP 0.15mmol/L,随机引物0.44μnol/L,TaqDNA聚合酶3.0U,模板DNA75ng;退火温度47℃,循环次数35次。

25份燕窝样品的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因序列分析

目的对多种燕窝进行DNA条形码鉴别,为确定燕窝的基原提供分子依据。方法对25份燕窝样品的细胞色素氧化酶Ⅰ(mitochondria cytochrome oxidase subunitⅠgene,COⅠ)条形码序列进行PCR扩增和测序,分析燕窝正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及序列相似性和进化树研究,用Taxon DNA软件评估"Barcoding Gap"。结果金丝燕种内COI序列变异小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出,燕窝不同来源个体均聚在一起,能够与其混伪品区分开。结论基于COⅠ序列的DNA条形码技术可以用于鉴定燕窝的正品来源及其混伪品。

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

基于部分线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mtCOI)DNA序列的6种蝙蝠(翼手目:蝙蝠科)的分子系统进化关系

对贵州5种蝙蝠科蝙蝠的部分线粒体细胞色素氧化酶亚基ⅠDNA序列进行了测定,并结合从Genbank获得的爪哇伏翼的相应序列,以Pteropus dasymallus,P.scapulatus,Rousettus aegyptiacus为外群,运用贝叶斯法(Bayes-ian),最大似然法(Maximum Likelihood,ML)分析了这6种蝙蝠科蝙蝠的分子系统进化关系。结果表明:在贝叶斯,ML树中,这6种蝙蝠科的蝙蝠可分为3个分支:亚洲长翼蝠是第1个独立出来的分支;白腹管鼻蝠是继亚洲长翼蝠之后第2个分离出来的分支;第3个分支又分为两支,一支由大鼠耳蝠和小鼠耳蝠组成,另一支由南蝠和爪哇伏翼组成,支持将这4种蝙蝠同归于蝙蝠亚科的结论,从一定程度上否定了鼠耳蝠属和管鼻蝠亚科之间的姐妹类群关系,也不支持将鼠耳属提升为亚科。

西方蜜蜂的线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基-Ⅰ~细胞色素氧化酶亚基-Ⅱ富含A+T非编码区单倍型类群

西方蜜蜂（Apis砌ZZ澹ra）的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）细胞色素氧化酶亚基-I（cytochrome C oxidase subunit I,COI）～细胞色素氧化酶亚基-II（COII）富含A＋T非编码区（AT-rich noncoding region，NC）属于高变异DNA序列，既呈现mtDNA长度变异又呈现mtDNA序列变异，它作为mtDNA多态性标记广泛地应用于A．m．地理亚种的DraI酶限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, DraI RFLP）分析和单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism, SNP）分析。在本文中，A．m．非洲世系mtDNA的28种DraI RFLP谱图被归纳为3种COI—COIINC单倍型类群，即P0、Q元件组成类群，P1、Q元件组成类群以及P2、Q元件组成类群；A．m.西部欧洲世系mtDNA的90种DraI RFLP谱图被归纳为1种COI—COIINC单倍型类群，即P、Q元件组成类群；A．砚东部欧洲世系mtDNA的25种SNP谱图被归纳为1种COI—COIINC单倍型类群，即Q元件组成类群；A．m．亚洲世系mtDNA的29种DraIRFLP谱图被归纳为3种COI—COIINC单倍型类群，即P0、Q元件组成类群，P0’、Q元件组成类群以及P1＇,Q元件组成类群。本文综述了这个研究进展。

西方蜜蜂的线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基-Ⅰ～细胞色素氧化酶亚基-Ⅱ富含A+T非编码区单倍型类群(续)

因此，根据A．m．的COI—COIINC单倍型类群分析的原始数据，A．m.非洲世系为DraI RFLP谱图表征的3个COI—COII NC单倍型类群（表1）。在A．耽进化过程中，阿尔卑斯山以北直至乌拉尔山的宽阔地域及其比邻的突尼斯、摩洛哥、撒哈拉沙漠近地中海地带等地是A．m.的一个自然分布区。

日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的克隆与初步分析

目的:了解日本血吸虫湖北株细胞色素C氧化酶亚基(mt co)基因的生物学特性.方法:以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物应用降落PCR扩增、纯化基因片段后连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆、测序并与NCBI数据库中的核酸序列进行同源性比对分析,利用蛋白质分析软件分析该序列编码蛋白的相关生物学特性.结果:克隆序列的结果表明co基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸;编码蛋白的等电点为6.28,相对分子量为59 KDα,具有一个细胞色素C氧化酶亚基的核心保守结构域.结论:日本血吸虫湖北株co基因与其他地理株具有较高的同源性.

蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基Ⅲ的序列及其分子进化分析

测定了蓖麻蚕Samiacynthiaricini线粒体基因组 (mtDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ (COX3)、tRNA Gly和部分的NADH亚基Ⅲ (ND3)基因的DNA片段序列。COX3基因编码框包含 789个核苷酸 ,编码 2 6 2个氨基酸的蛋白质。通过同源性比较 ,发现COX3基因的 3′端比 5′端要保守 ,其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在。COX3的下游为 6 6bp的tRNA Gly基因。蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是 80 2 %和 85 6 %。根据COX3氨基酸序列进行了 12种无脊椎动物的分子进化树分析 ,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时 ,应该综合考虑物种的繁殖模式及生态特点。

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列的细胞种属鉴别及细胞交叉污染分析

目的建立一种快速、简便、敏感和特异的基于线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,CoI)基因序列的细胞基质检测方法,用于细胞种属鉴别和不同种属间的细胞交叉污染分析。方法①提取非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、狗肾细胞(MDCK细胞)和牛肾细胞(MDBK细胞)基因组DNA,以PCR扩增相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因条码序列,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与文献报道的来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守区的基因条码序列片段大小进行对比,以确定细胞的种属类别;②用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与相应细胞和其他不同种属的细胞的基因组DNA进行PCR扩增,检测方法的特异性;用不同浓度的细胞基因组DNA与相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物进行PCR扩增,检测方法的灵敏度;③以不同种属细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与多种细胞混合液提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增,检测细胞间的交叉污染。结果 Vero细胞、MDCK细胞及MDBK细胞线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小,与来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小相符。该方法具备较好的特异性,检测灵敏度为1.0 ng/μL,不同种属间细胞的交叉污染可被检出。结论该方法可有效地判断细胞的种属来源,亦可用于不同种属间细胞交叉污染的分析。

缺氧对大鼠大脑皮质细胞色素氧化酶亚基Ⅰ、Ⅳ表达协同性的影响

本文探讨缺氧对细胞色素氧化酶 (cytochromeoxidase ,COX ,即complexⅣ )的mtDNA和nDNA编码亚基Ⅰ、Ⅳ表达及其协同性的影响。实验用成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、缺氧 2、5、15和 3 0d组。缺氧大鼠于低压舱内模拟海拔 5 0 0 0m连续减压。对照组大鼠于舱外同时喂养 (舱外海拔高度为 3 0 0m)。用半定量逆转录 PCR法测定大脑皮质COXⅠ、ⅣmRNA量 ,用Westernblot分析大脑皮质线粒体COXⅠ、Ⅳ蛋白量 ,以两个亚基的蛋白量、mRNA量的比值反映亚基表达的协同性。结果显示 ,缺氧 2、5d ,COXⅠmRNA增加 ,缺氧 15、3 0d时下降至对照水平。缺氧 2、5和 15d时 ,COXⅣmRNA显著增加 ,缺氧 3 0d时降低 ,与对照组差异非常显著。COXⅣ、ⅠmRNA比值在缺氧 15d时最高 ,其它各缺氧组与对照组的差异无显著意义。各组COXⅠ、Ⅳ蛋白量及其比值均无显著差异。上述结果表明 ,缺氧可影响COXⅠ、ⅣmRNA的表达及其协同性 ,但对蛋白的表达及其协同性没有显著影响 ,提示转录后调节是缺氧过程中线粒体内COXⅠ。

微波对大鼠脑线粒体细胞色素C氧化酶亚基转录水平的影响

目的 观察微波辐照对大鼠大脑皮层和海马组织线粒体编码基因COXⅠ和核编码基因COXⅣmRNA表达水平的影响 ,探讨微波辐照是否影响线粒体能量代谢。方法 平均功率密度为 3mW /cm2 和 3 0mW /cm2 微波急性辐照大鼠 1h后 ,应用RT PCR检测大鼠大脑皮层和海马组织COXⅠ和COXⅣ基因转录水平的变化。结果 3mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠ、COXⅣmRNA表达无显著变化。 3 0mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠmRNA表达均明显降低 ,而COXⅣmRNA表达无显著变化。结论 微波辐照下调大鼠大脑皮层和海马线粒体编码基因COXⅠmRNA表达 ,并存在剂量依赖关系 。

外源乙烯对桃果实采后贮藏过程中线粒体内细胞色素氧化酶的影响

以硬溶质型桃果实‘加纳岩’为试材,研究外源乙烯处理对桃果实采后贮藏过程中呼吸速率、乙烯释放量、细胞色素氧化酶(cytochrome C oxidase,COX)活性以及线粒体编码的COX 3种亚基(COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ)基因表达量的影响。结果表明:外源乙烯处理加速了硬溶质型桃果实‘加纳岩’在采后贮藏过程中硬度的下降,促进了呼吸作用和内源乙烯释放,使呼吸高峰和乙烯释放高峰提前出现。同时外源乙烯抑制了COX酶活性,抑制了贮藏后期COXⅠ和COXⅡ亚基基因的表达,抑制了整个贮藏过程中COXⅢ亚基基因的表达。外源乙烯处理抑制了COX途径的呼吸,加速了果实的软化衰老。

颞叶癫痫大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅲ和Ⅳ表达的变化

目的:探讨癫痫对大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶(COX)的mtDNA和nDNA编码亚基Ⅲ、Ⅳ表达的影响。方法:将成年雄性Wistar大鼠40只随机分为生理盐水对照组,癫痫持续状态(SE)后急性期(3 h)、静止期(7 d)、慢性期(45 d)组和注射匹鲁卡品(PILO)但未出现SE组,每组8只。荧光实时定量PCR和West-ern blot分别检测海马线粒体COXⅢ、ⅣmRNA和蛋白的表达。结果:COXⅢmRNA和蛋白在SE后3 h表达明显升高(P<0.001,P<0.01),7 d时降到对照水平,45 d显著降低(P<0.001,P<0.01);COXⅣmRNA和蛋白在3 h时表达较对照组升高,但差异无统计学意义(P>0.05),7 d和45 d时下降至对照水平。注射PILO但无SE组与对照组结果类似。结论:颞叶癫痫海马cox功能紊乱与痫性发作相关,线粒体编码的基因更易受痫性发作的影响。

过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究

目的 探讨过氧化氢 (H2 O2 )导致线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素C氧化酶 (COX)基因损伤(突变 )后对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系。方法 采用生物信息学技术 ,运用计算机同源模建的方法模拟人天然COX亚单位和其突变体的空间结构 ,并利用已有的实验数据 ,结合模建的结果进行了结构、功能的分析、研究。结果 在COXⅠ的三维结构中突变的部位 (残基 2 97～ 30 6 )位于分子的最外部 ,而该区域参与了与B亚基 (相当于COXⅡ亚基 )的作用 ,该部位的突变使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化 ,导致附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特性出现变化 ,这些变化对酶复合物的形成有直接的影响 ;COXⅡ突变后 ,组成分子结构的“椅靠”部分和“椅面”部分之间的夹角略有增大 ,而“椅靠”和“椅面”之间的夹角的变化将会影响整个酶分子的稳定性。结论 H2 O2 导致的mtDNA编码COXⅠ、COXⅡ亚基基因突变使其编码的COX蛋白空间结构发生改变 ,这种改变是其功能改变 (如酶蛋白活性下降 )的主要原因。

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)亚基Ⅲ基因(mtCOXⅢ)的相关信息设计引物,运用PCR技术,首次从亚洲黑熊四川亚种(以下简称四川黑熊,Ursus thibetanus mupinensis)的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列,并对其进行了初步分析.结果表明:四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp,ORF是783 bp,编码261个氨基酸的蛋白质,该蛋白的等电点为6.47,分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现,四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的:通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。方法:根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,插入到pENTR/U6质粒缺口末端,连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体;通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest载体上,构建含U6启动子、靶序列和PolⅢ终止子表达框的MTCOX-IshRNA表达重组体;经脂质体导入293FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度。Westernblotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结果:将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒。Westernblotting检测结果证实构建的MTCOX-IshRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结论:成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。

不同地理株旋毛虫细胞色素氧化酶Ⅰ基因多态性的PCR-单链构象多态性分析

目的:观察不同地理株旋毛虫细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ)基因片段的多态性。方法:根据旋毛虫mtD-NACOXⅠ设计引物,应用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对我国7个猪源旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)地理株(河南、湖北、云南、西安、天津、黑龙江同江及哈尔滨株)与1个波兰猪源旋毛虫(T1,编号ISS3)地理株进行COXⅠ基因片段多态性进行分析。结果:我国7个猪源旋毛虫地理株与波兰地理株COXⅠ基因均扩增出约400bp的片段,PCR扩增产物经SSCP检测发现有3种基因型(AA、AB和BB),波兰地理株为AA型,黑龙江同江、哈尔滨、西安、云南、湖北及河南株均为AB型,天津株为BB型,其中以AB基因型频率最高(0.75),AA与BB基因型均为0.125;A和B等位基因频率均为0.5;旋毛虫不同地理株COXⅠ基因的多态性信息含量为0.375,为中度多态性。结论:8个不同地理株猪源旋毛虫的COXⅠ基因为中度多态性。

不同溶质型桃果实成熟衰老过程中线粒体内细胞色素氧化酶的变化

以软溶质型桃‘雨花3号’和硬溶质型桃‘加纳岩’果实为试材,研究不同溶质型桃成熟衰老过程中细胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)活性以及线粒体编码的COX 3种亚基(COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ)基因表达量的变化。结果表明:桃果实成熟前期,COX活性不断增加,成熟后期,COX活性开始下降。‘加纳岩’COX 3种亚基基因的表达量高于‘雨花3号’,且COX 3种亚基在桃果实成熟前期表达量较高。说明线粒体DNA编码的COX 3种亚基主要作用于桃果实成熟前期,为果实生长代谢提供所需能量,到了后期表达量降低,活性受影响,导致果实线粒体内的活性氧积累,机体代谢失衡,呼吸速率增加,线粒体编码的COX 3种亚基与桃果实成熟衰老之间存在一定的内在联系。

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。