桑天牛线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因的PCR反应体系优化

建立一整套适用于研究桑天牛线粒体细胞色素氧化酶I(mtDNA CO I)基因的PCR反应体系,研究不同地理分布的桑天牛遗传多样性。通过L_(16)(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验对缓冲液(Mg^(2+))、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,50μL反应体系及反应程序中各因素优化组合为:缓冲液(含Mg^(2+))0.9mmol/L,dNTP 0.15mmol/L,随机引物0.44μnol/L,TaqDNA聚合酶3.0U,模板DNA75ng;退火温度47℃,循环次数35次。

25份燕窝样品的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因序列分析

目的对多种燕窝进行DNA条形码鉴别,为确定燕窝的基原提供分子依据。方法对25份燕窝样品的细胞色素氧化酶Ⅰ(mitochondria cytochrome oxidase subunitⅠgene,COⅠ)条形码序列进行PCR扩增和测序,分析燕窝正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及序列相似性和进化树研究,用Taxon DNA软件评估"Barcoding Gap"。结果金丝燕种内COI序列变异小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出,燕窝不同来源个体均聚在一起,能够与其混伪品区分开。结论基于COⅠ序列的DNA条形码技术可以用于鉴定燕窝的正品来源及其混伪品。

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

细胞色素氧化酶P4502C19基因多态检测联合血清肝素辅助因子Ⅱ对下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄的预测价值

目的探讨细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)基因多态检测联合血清肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ)对下肢动脉硬化闭塞症(ASO)介入术后再狭窄的预测价值。方法收集2017年1月至2021年5月于绵阳市第三人民医院行介入治疗的146例ASO患者的临床资料,根据随访期间再狭窄发生情况将其分为再狭窄组(n=27)和无再狭窄组(n=119)。收集患者性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、心脑血管病史、高同型半胱氨酸病史、病变血管支数、术前狭窄情况、支架植入情况、纤维蛋白原水平、总胆固醇水平、红细胞计数、CYP2C19基因多态性、HCⅡ活性,分析ASO介入术后再狭窄的影响因素。结果有吸烟史、支架植入、CYP2C19慢代谢型及HCⅡ活性均为ASO支架植入术后发生再狭窄的独立危险因素(P﹤0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线结果显示,HCⅡ活性预测ASO支架植入术后再狭窄的截断值为95.80%,曲线下面积(AUC)为0.809(95%CI:0.719~0.900),灵敏度为74.80%,特异度为88.24%,Kappa=0.566。CYP2C19基因多态检测对ASO支架植入术后再狭窄的预测灵敏度为66.67%,特异度为89.07%,Kappa=0.537。联合检测对ASO支架植入术后再狭窄的预测灵敏度为96.30%,特异度为86.55%,Kappa=0.682。结论ASO介入术后再狭窄与吸烟史、支架植入情况、CYP2C19基因多态性及HCⅡ活性有关,CYP2C19基因多态性及HCⅡ活性检测均可用于预测ASO介入术后再狭窄,但联合检测可提高其诊断效能。

日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的克隆与初步分析

目的:了解日本血吸虫湖北株细胞色素C氧化酶亚基(mt co)基因的生物学特性.方法:以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物应用降落PCR扩增、纯化基因片段后连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆、测序并与NCBI数据库中的核酸序列进行同源性比对分析,利用蛋白质分析软件分析该序列编码蛋白的相关生物学特性.结果:克隆序列的结果表明co基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸;编码蛋白的等电点为6.28,相对分子量为59 KDα,具有一个细胞色素C氧化酶亚基的核心保守结构域.结论:日本血吸虫湖北株co基因与其他地理株具有较高的同源性.

蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基Ⅲ的序列及其分子进化分析

测定了蓖麻蚕Samiacynthiaricini线粒体基因组 (mtDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ (COX3)、tRNA Gly和部分的NADH亚基Ⅲ (ND3)基因的DNA片段序列。COX3基因编码框包含 789个核苷酸 ,编码 2 6 2个氨基酸的蛋白质。通过同源性比较 ,发现COX3基因的 3′端比 5′端要保守 ,其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在。COX3的下游为 6 6bp的tRNA Gly基因。蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是 80 2 %和 85 6 %。根据COX3氨基酸序列进行了 12种无脊椎动物的分子进化树分析 ,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时 ,应该综合考虑物种的繁殖模式及生态特点。

过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究

目的 探讨过氧化氢 (H2 O2 )导致线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素C氧化酶 (COX)基因损伤(突变 )后对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系。方法 采用生物信息学技术 ,运用计算机同源模建的方法模拟人天然COX亚单位和其突变体的空间结构 ,并利用已有的实验数据 ,结合模建的结果进行了结构、功能的分析、研究。结果 在COXⅠ的三维结构中突变的部位 (残基 2 97～ 30 6 )位于分子的最外部 ,而该区域参与了与B亚基 (相当于COXⅡ亚基 )的作用 ,该部位的突变使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化 ,导致附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特性出现变化 ,这些变化对酶复合物的形成有直接的影响 ;COXⅡ突变后 ,组成分子结构的“椅靠”部分和“椅面”部分之间的夹角略有增大 ,而“椅靠”和“椅面”之间的夹角的变化将会影响整个酶分子的稳定性。结论 H2 O2 导致的mtDNA编码COXⅠ、COXⅡ亚基基因突变使其编码的COX蛋白空间结构发生改变 ,这种改变是其功能改变 (如酶蛋白活性下降 )的主要原因。

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)亚基Ⅲ基因(mtCOXⅢ)的相关信息设计引物,运用PCR技术,首次从亚洲黑熊四川亚种(以下简称四川黑熊,Ursus thibetanus mupinensis)的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列,并对其进行了初步分析.结果表明:四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp,ORF是783 bp,编码261个氨基酸的蛋白质,该蛋白的等电点为6.47,分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现,四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.

基于线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)序列的猪和兔四个疥螨分离株的系统发育关系分析

为了探讨兔疥螨分离株和猪疥螨分离株的分类地位,采用PCR技术首次扩增了分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427bp,序列间无插入、缺失,A+T含量(73%)明显高于G+C含量(27%),碱基组成存在明显偏移。猪和兔的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高(99.1%～100.0%),它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%～99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。

不同地理株旋毛虫细胞色素氧化酶Ⅰ基因多态性的PCR-单链构象多态性分析

目的:观察不同地理株旋毛虫细胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ)基因片段的多态性。方法:根据旋毛虫mtD-NACOXⅠ设计引物,应用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对我国7个猪源旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)地理株(河南、湖北、云南、西安、天津、黑龙江同江及哈尔滨株)与1个波兰猪源旋毛虫(T1,编号ISS3)地理株进行COXⅠ基因片段多态性进行分析。结果:我国7个猪源旋毛虫地理株与波兰地理株COXⅠ基因均扩增出约400bp的片段,PCR扩增产物经SSCP检测发现有3种基因型(AA、AB和BB),波兰地理株为AA型,黑龙江同江、哈尔滨、西安、云南、湖北及河南株均为AB型,天津株为BB型,其中以AB基因型频率最高(0.75),AA与BB基因型均为0.125;A和B等位基因频率均为0.5;旋毛虫不同地理株COXⅠ基因的多态性信息含量为0.375,为中度多态性。结论:8个不同地理株猪源旋毛虫的COXⅠ基因为中度多态性。

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。

6种鼠类细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因的分子进化分析

目的了解无锡市鼠类细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因的特征和鼠类分子系统进化关系。方法对褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠、社鼠、白腹巨鼠的COI基因进行了扩增测序,分析了基因特征、颠换率、遗传距离,在Gen Bank中对序列进行相似性比对,利用MEGA4.1构建分子系统树。结果 6种鼠类的COI基因序列扩增长度为706~724 bp,GC含量为40.3%~42.0%;种内颠换率为0.00%~2.17%,遗传距离为0.000~0.023;种间颠换率为8.82%~15.02%,遗传距离为0.099~0.193;每种鼠类为单系群的支持值都为100。结论鼠类的COI基因具有种属特异性,可以用于鼠类的分类鉴别。

缺血缺氧与线粒体DNA编码细胞色素氧化酶基因损伤

细胞色素氧化酶是线粒体呼吸链氧化磷酸化过程中的关键酶 ,缺血缺氧与线粒体DNA编码细胞色素氧化酶基因损伤关系密切。

两个藏系绵羊类群细胞色素氧化酶Ⅰ基因序列多态性及系统进化分析

为了从分子水平研究藏系绵羊贾洛类群和红原类群的遗传多样性和系统进化，试验采用PCR和测序方法对贾洛类群、红原类群、新疆细毛羊共25个样品的线粒体细胞色素氧化酶I（COI）基因全序列进行分析。结果表明：3个绵羊品种（类群）的COI基因序列全长为1545bp，共定义11种单倍型，单倍型多样性为0．464—0．806，核苷酸多样性为0．00227～0．00461，红原类群的遗传多样性比贾洛类群和新疆细毛羊丰富。25只个体的系统发育树呈现3个明显分支，支持绵羊有3个独立母系起源的观点；红原类群和新疆细毛羊为3个支系，贾洛类群为2个支系。3个群体间的分子系统发育树显示，红原类群与贾洛类群聚在一起，新疆细毛羊为相对独立的一支。说明COI基因可以用于分析绵羊品种间或不同类群间的系统进化。

基于细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因的动物分子系统学概述

DNA分子作为动物分类标记不受形态特征、发育阶段及环境等因素影响。线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因进化速率适中，作为动物分子系统学研究的分子标记十分理想。目前，该基因在动物系统发育关系重建、种群遗传变异和分化、行为起源与进化、近缘种或种下分类单元的鉴定、生物地理与系统发育的关系以及DNA条形码等领域的应用研究正在逐步深入。

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列的细胞种属鉴别及细胞交叉污染分析

目的建立一种快速、简便、敏感和特异的基于线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,CoI)基因序列的细胞基质检测方法,用于细胞种属鉴别和不同种属间的细胞交叉污染分析。方法①提取非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、狗肾细胞(MDCK细胞)和牛肾细胞(MDBK细胞)基因组DNA,以PCR扩增相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因条码序列,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与文献报道的来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守区的基因条码序列片段大小进行对比,以确定细胞的种属类别;②用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与相应细胞和其他不同种属的细胞的基因组DNA进行PCR扩增,检测方法的特异性;用不同浓度的细胞基因组DNA与相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物进行PCR扩增,检测方法的灵敏度;③以不同种属细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与多种细胞混合液提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增,检测细胞间的交叉污染。结果 Vero细胞、MDCK细胞及MDBK细胞线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小,与来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小相符。该方法具备较好的特异性,检测灵敏度为1.0 ng/μL,不同种属间细胞的交叉污染可被检出。结论该方法可有效地判断细胞的种属来源,亦可用于不同种属间细胞交叉污染的分析。

阿尔茨海默病患者血液细胞线粒体内细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因存在缺失

目的 调查 2 5例老年痴呆患者血细胞线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的突变情况 ,探讨线粒体DNA突变与阿尔茨海默病 (AD)性老年痴呆发生发展的关系。 方法 采用微量法提取血细胞总DNA直接作为PCR模板 ,进行巢式PCR扩增 ,最后采用DNA序列分析鉴定突变。 结果 在正常老人组 ,只扩增了 2 80bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因 (COX2 )扩增片段 ,而在老年痴呆患者中出现了 4 6 4bp和 2 80bp的多态性扩增片段 ,并且发现了 1个 32 0bp的新的线粒体DNA缺失片段 ,1位AD患者的COX2基因存在一种新的缺失后重组现象 ,COX2基因的 1条单链在np75 0 3处断裂 ,另 1条单链在np7785处断裂 ,这两个断裂的游离片段通过插入 1个额外的胞嘧啶核苷酸重新连接起来。 结论 老年痴呆患者中的COX2基因存在片段扩增多态性。

乳腺癌线粒体细胞色素氧化酶-Ⅱ基因突变检测

目的研究乳腺癌患者线粒体DNA(mtDNA)细胞色素氧化酶-Ⅱ区基因突变情况。方法采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对20例乳腺癌患者癌组织和和癌旁组织线粒体DNA的细胞色素氧化酶-Ⅱ区扩增并测序,检测突变情况。结果 20例乳腺癌患者癌组织中共有4例mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区存在突变,癌旁组织中共有2例mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区存在突变。在20例乳腺癌组织中共有4个位点发生了突变,其中引起编码氨基酸改变的突变有1个。结论 mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区突变与乳腺癌发生、发展有相关性。

线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因突变与疾病

细胞色素氧化酶在人体内分布十分广泛 ,它的突变与人类疾病发生有密切的关系 ,通过分析线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因的结构特点及其突变引起的主要疾病和其临床表现 ,比较了人类常见疾病和线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因突变位点之间的关系 。

郑州地区4种尸食性苍蝇线粒体DNA中细胞色素氧化酶亚基基因序列检测

目的:通过检测尸食性苍蝇线粒体DNA(mtDNA)中细胞色素氧化酶亚基(COⅠ)中305bp基因序列,鉴定尸食性苍蝇的种类,解决依据形态学不能鉴定苍蝇幼虫种类的难题。方法:随机采集郑州市区、郊区等不同放置地点的实验动物尸体上的2科4种共17个苍蝇的成虫、蛹、卵为样本,提取上述样本的mtDNA进行PCR扩增,产物检测与纯化、正反双向测序,并使用相关软件进行序列拼接、比对及进化距离分析,并构建种内和种间的系统发育树。结果:种内进化分歧均数小于1%,种间进化分歧均数大于1%,具有统计学意义。结论:尸食性苍蝇mtD-NA中COⅠ序列分析能有效地对尸食性苍蝇的种类进行鉴定,该方法简便、快捷、准确,可作为法医鉴别尸食性苍蝇种类的可靠依据。