微波对大鼠脑线粒体细胞色素C氧化酶亚基转录水平的影响

目的 观察微波辐照对大鼠大脑皮层和海马组织线粒体编码基因COXⅠ和核编码基因COXⅣmRNA表达水平的影响 ,探讨微波辐照是否影响线粒体能量代谢。方法 平均功率密度为 3mW /cm2 和 3 0mW /cm2 微波急性辐照大鼠 1h后 ,应用RT PCR检测大鼠大脑皮层和海马组织COXⅠ和COXⅣ基因转录水平的变化。结果 3mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠ、COXⅣmRNA表达无显著变化。 3 0mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠmRNA表达均明显降低 ,而COXⅣmRNA表达无显著变化。结论 微波辐照下调大鼠大脑皮层和海马线粒体编码基因COXⅠmRNA表达 ,并存在剂量依赖关系 。

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究

目的 探讨过氧化氢 (H2 O2 )导致线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素C氧化酶 (COX)基因损伤(突变 )后对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系。方法 采用生物信息学技术 ,运用计算机同源模建的方法模拟人天然COX亚单位和其突变体的空间结构 ,并利用已有的实验数据 ,结合模建的结果进行了结构、功能的分析、研究。结果 在COXⅠ的三维结构中突变的部位 (残基 2 97～ 30 6 )位于分子的最外部 ,而该区域参与了与B亚基 (相当于COXⅡ亚基 )的作用 ,该部位的突变使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化 ,导致附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特性出现变化 ,这些变化对酶复合物的形成有直接的影响 ;COXⅡ突变后 ,组成分子结构的“椅靠”部分和“椅面”部分之间的夹角略有增大 ,而“椅靠”和“椅面”之间的夹角的变化将会影响整个酶分子的稳定性。结论 H2 O2 导致的mtDNA编码COXⅠ、COXⅡ亚基基因突变使其编码的COX蛋白空间结构发生改变 ,这种改变是其功能改变 (如酶蛋白活性下降 )的主要原因。

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)亚基Ⅲ基因(mtCOXⅢ)的相关信息设计引物,运用PCR技术,首次从亚洲黑熊四川亚种(以下简称四川黑熊,Ursus thibetanus mupinensis)的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列,并对其进行了初步分析.结果表明:四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp,ORF是783 bp,编码261个氨基酸的蛋白质,该蛋白的等电点为6.47,分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现,四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。

利拉鲁肽基于线粒体-细胞色素C介导心肌细胞凋亡

目的探讨利拉鲁肽在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)处理的心肌细胞中的作用及其潜在机制。方法建立大鼠心肌细胞株(H9C2)H/R模型以模拟体外心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]和Annexin V FITC-PI染色法测定细胞增殖和凋亡。检测细胞氧化应激产物和线粒体功能。用蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞凋亡蛋白表达和细胞色素C的释放。结果利拉鲁肽保护H9C2细胞免受H/R诱导的损伤,因其可减弱H/R对H9C2细胞活力、细胞凋亡和活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的影响(P<0.05)。利拉鲁肽可保护线粒体功能并防止H/R损伤后H9C2细胞中细胞色素C的释放(P<0.05)。结论阐明了利拉鲁肽在治疗I/R相关心肌损伤中的潜在心血管保护作用。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞色素C家族afe_0378基因转录表达差异及生物信息学挖掘

嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种极为重要的浸矿微生物,具有氧化各种还原性含硫物及亚铁等功能。采用实时荧光定量PCR技术及生物信息学等手段对该菌一个涉及铁硫氧化由afe_0378基因编码的细胞色素C家族蛋白CycA2进行了研究。结果表明,afe_0378基因在单质硫培养条件下转录水平是亚铁培养条件下的2.67倍。生物信息学分析表明afe_0378编码蛋白CycA2是分子质量为22.959 ku,pI为9.75的结合内膜的周质蛋白,二级结构为全α-螺旋,无β-折叠,包含2个相似结构域及N端一段跨膜疏水螺旋,属于细胞色素C4型蛋白家族。CycA2蛋白分子三维结构模建表明,双血红素与CycA2蛋白序列片段域C48-X-X-C51-H52及C149-X-X-C152-H153中的半胱氨酸共价连接。结合该菌硫代谢背景知识,推测CycA2蛋白的功能是介导细胞色素bc1复合体及终端氧化酶细胞色素aa3复合体之间的电子传递而参与硫代谢。

稻纵卷叶螟线粒体基因组及细胞色素C氧化酶基因分析

线粒体基因是研究生物系统进化的重要分子标记,本文对迁飞昆虫稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis线粒体DNA进行扩增及注释,结果表明:稻纵卷叶螟线粒体基因组全长15377bp,AT含量为82%,基因组结构为鳞翅目所特有的CR-M-I-Q结构。以细胞色素C氧化酶基因(COX)为分子标记,对有翅类昆虫22个物种进行系统树构建,发现与昆虫翅的发生高度吻合。对存在于PCGs终止密码子判定的争议予以阐明并提出注释建议,有利于今后动物线粒体基因组序列注释的统一规范。

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列的细胞种属鉴别及细胞交叉污染分析

目的建立一种快速、简便、敏感和特异的基于线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,CoI)基因序列的细胞基质检测方法,用于细胞种属鉴别和不同种属间的细胞交叉污染分析。方法①提取非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、狗肾细胞(MDCK细胞)和牛肾细胞(MDBK细胞)基因组DNA,以PCR扩增相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因条码序列,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与文献报道的来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守区的基因条码序列片段大小进行对比,以确定细胞的种属类别;②用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与相应细胞和其他不同种属的细胞的基因组DNA进行PCR扩增,检测方法的特异性;用不同浓度的细胞基因组DNA与相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物进行PCR扩增,检测方法的灵敏度;③以不同种属细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与多种细胞混合液提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增,检测细胞间的交叉污染。结果 Vero细胞、MDCK细胞及MDBK细胞线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小,与来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小相符。该方法具备较好的特异性,检测灵敏度为1.0 ng/μL,不同种属间细胞的交叉污染可被检出。结论该方法可有效地判断细胞的种属来源,亦可用于不同种属间细胞交叉污染的分析。

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的:通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。方法:根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,插入到pENTR/U6质粒缺口末端,连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体;通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest载体上,构建含U6启动子、靶序列和PolⅢ终止子表达框的MTCOX-IshRNA表达重组体;经脂质体导入293FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度。Westernblotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结果:将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒。Westernblotting检测结果证实构建的MTCOX-IshRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结论:成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。

一氧化氮对肝癌细胞线粒体膜通透性和胞浆中细胞色素C含量的影响

目的探讨一氧化氮(NO)对肝癌细胞线粒体膜通透性和胞浆中细胞色素C穴cytC雪含量的影响。方法用NO供体硝普钠(SNP)诱导SMMC-7721和HepG2肝癌细胞株凋亡熏流式细胞术检测SMMC-7721和HepG2细胞凋亡率,MTT法观察肝癌细胞生长增殖情况熏流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位变化,Westernblot检测胞浆中cytC含量的变化熏同时应用线粒体膜通透性转变孔开放抑制剂CsA和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂BSO预处理细胞,并观察以上各指标的变化。结果SNP能诱导人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2凋亡,并可导致两株细胞线粒体跨膜电位下降,胞浆中cytC含量增加,与SNP的作用时间成正比。CsA能够抑制SNP所致的肝癌细胞线粒体跨膜电位的下降及胞浆中cytC含量的增加;而BSO则可促进线粒体跨膜电位下降,cytC从线粒体释放到胞浆。结论NO可能通过下调线粒体跨膜电位、开放线粒体膜通透性转变孔并释放线粒体cytC,来诱导SMMC-7721和HepG2细胞凋亡。

CDC25C表达下调的黑色素瘤细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡情况观察

目的探讨细胞分裂周期蛋白25C(CDC25C)对黑色素瘤B16细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡的影响。方法取黑色素瘤B16细胞进行培养,将细胞随机分为转染组、转染对照组、空白对照组。转染组转染CDC25C低表达慢病毒质粒,转染对照组转染慢病毒空质粒,空白对照组正常培养。利用Rhod-2/AM与MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内Ca^(2+)浓度及线粒体活性氧(ROS),RT-qPCR法和Western blotting法分别检测细胞线粒体应激反应相关分子ClpP、LONP1及线粒体途径凋亡相关分子Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白表达。结果与转染对照组和空白对照组相比,转染组细胞线粒体Ca^(2+)及ROS含量增加,ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05或<0.01)。结论CDC25C表达下调激活黑色素瘤B16细胞发生线粒体应激反应,并诱导线粒体途径的细胞凋亡。

细胞色素c在线粒体中的抗氧化功能

实验论证了细胞色素c在线粒体中具有很强的抗氧化能力,氧化态细胞色素c能清除O2-.,还原态细胞色素c能清除H2O2。

布氏田鼠肝脏内线粒体蛋白含量及细胞色素c氧化酶活性的变化

为探讨线粒体能量代谢中细胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase,CcO)在布氏田鼠(Microtusbrandti)生长发育过程中的作用,应用紫外分光光度法测定了不同日龄的幼鼠肝脏内线粒体蛋白含量及CcO活性。结果发现根据幼鼠肝脏内线粒体蛋白的含量可将生长发育大致分为3个阶段:1～3日龄,4～19日龄,20日龄至成体。CcO活性变化趋势则呈倒钟形,以17日龄的CcO活性为最高。据此推测布氏田鼠肝脏内CcO的活性可能与恒温机制的建立有关系。

血清细胞色素C、基质金属蛋白酶9对慢性阻塞性肺疾病的诊断价值

探讨血清MMP-9、CytC水平变化对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的诊断及病情评估的价值。方法 选取2019年11月至2022年10月在新乡医学院第一附属医院接受治疗的160例COPD患者为观察组,80例同期健康体检者为对照组。酶联免疫法监测入选者血清MMP-9、CytC水平并完善氧分压、第一秒用力呼气容积、中性粒细胞等资料。对比两组间血清MMP-9、CytC水平差异。Pearson相关分析评价血清细胞色素C、基质金属蛋白酶9水平与CRP的相关性。以COPD的发生为结果,分别建立血清MMP-9、CytC水平的受试者工作特征曲线(ROC)。通过曲线下面积(AUC)评估血清MMP-9、CytC对COPD的诊断价值。结果 血清MMP-9、CytC、NEUT及CRP水平观察组高于对照组,而PaO2、FEV1%观察组低于对照组,(P均<0.05)。血清细胞色素C、基质金属蛋白酶9水平与CRP正相关(r=0.492、0.403,P<0.05)。血清CytC诊断COPD的AUC为0.751,敏感度和特异度分别为60.63%、86.25%。血清MMP-9诊断COPD的AUC为0.897,敏感度和特异度分别为80.63%、93.75%。结论 COPD患者血清CytC、MMP-9水平升高。血清CytC、MMP-9水平与COPD肺功能下降及炎症反应有关,监测血清MMP-9、CytC水平有助于COPD的诊断及病情活动程度的评估。

线粒体钙、细胞色素C与髓过氧化物酶在妊高征发病中的作用

目的:探讨线粒体钙、细胞色素C及髓过氧化物酶在妊高征发病中的作用。方法:线粒体钙采用火焰原子吸收法测定,细胞色素C测定用的张均田法,胎盘组织中中性粒细胞髓过氧化物酶(M PO)活性用分光光度计比色法检测。结果:重度妊高征组胎盘组织线粒体C a2+、M PO含量均显著高于中度妊高征及正常组(P<0.05);中度妊高征组胎盘组织线粒体C a2+、M PO含量与正常组比较均无显著性差异(P>0.05);重度妊高征组胎盘组织细胞色素C含量显著低于中度妊高征组及正常组(P<0.05)。中度妊高征组胎盘组织细胞色素C含量显著低于正常组(P<0.05)。结论:重度妊高征妇女胎盘组织线粒体钙含量高于正常孕妇,提示其参与了妊高征患者胎盘微小动脉痉挛的病理生理改变;妊高征妇女胎盘组织细胞色素C含量明显低于正常孕妇,提示线粒体能量产生异常参与妊高征发病过程;重度妊高征妇女胎盘组织髓过氧化物酶含量较正常孕妇相比增高,支持妊高征发病的中性粒细胞活化导致的内皮细胞损伤学说。

耗竭运动时线粒体心磷脂含量和细胞色素C氧化酶活性的改变

本实验结果显示,大鼠耗竭游泳时,心肌和股四头肌线粒体脂质过氧化水平升高,心磷脂含量下降,并同时测定到细胞色素C氧化酶活性的降低。

小鼠脑组织细胞色素C氧化酶活性、线粒体细胞色素含量与年龄关系

目的:研究小鼠脑细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase,CCO)活性、线粒体细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)含量与年龄的关系,为法医学年龄推断提供新的思路。方法:利用紫外分光光度法检测了1、3、6、9、12月龄昆明小鼠的脑组织CCO活性及线粒体Cyt C含量。结果:小鼠脑组织CCO活性、线粒体Cyt C含量,随着年龄增大而逐渐降低。结论:脑组织CCO活性及线粒体Cyt C含量有望用于年龄推断。

细胞色素C氧化酶亚基Cox4的克隆及高效表达

Cox4是电子传递链上复合体Ⅳ的1个关键亚基,实现Cox4的高效表达以及制备其抗体,对于线粒体功能研究至关重要。根据裂殖酵母序列信息数据库(S.pombe_Gene DB)中cox4的基因序列(登录号:SPAC1296.02)设计引物,以粟酒裂殖酵母的c DNA序列为模板,通过PCR扩增技术得到目标蛋白的基因,然后通过克隆构建到含有T7强启动子的表达载体p ET-28a(+)上,并将其转入大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中实现重组工程菌株的构建。结果表明,通过一系列条件优化实现了对重组工程菌株中Cox4的高效表达,并纯化得到大量相应蛋白,最后以纯化的蛋白为抗原成功制备了Cox4抗体。Cox4抗体的成功制备为粟酒裂殖酵母中线粒体功能研究奠定了基础。

脱辅基细胞色素c定向于线粒体的转运特异性研究

用分离纯化的完整线粒体和部分细胞器组分,初步研究了脱辅基细胞色素c在细胞内转运的特异性。完整线粒体用差速离心和密度梯度离心的方法,从幼龄鸡心肌组织中获得,对胞内几种细胞器标志酶比活力的测量表明,纯化的线粒体单胺氧化酶活力提高25.6倍,腺苷酸激酶活力提高3.59倍,细胞色素c氧化酶活力提高5.48倍,外膜完整性达90%以上,呼吸控制率大于20。以上数据表明该纯化的线粒体受胞内其它囊泡成分污染少,外膜完整并具有较高的氧化磷酸化偶联效率;在纯化线粒体的同时,得到另两种细胞器组分-内质网和溶酶体囊泡。体外转录翻译的apo.c与上述几个组分的结合实验表明,完整线粒体与apo.c的结合能力明显高于其它组分。