基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

微波对大鼠脑线粒体细胞色素C氧化酶亚基转录水平的影响

目的 观察微波辐照对大鼠大脑皮层和海马组织线粒体编码基因COXⅠ和核编码基因COXⅣmRNA表达水平的影响 ,探讨微波辐照是否影响线粒体能量代谢。方法 平均功率密度为 3mW /cm2 和 3 0mW /cm2 微波急性辐照大鼠 1h后 ,应用RT PCR检测大鼠大脑皮层和海马组织COXⅠ和COXⅣ基因转录水平的变化。结果 3mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠ、COXⅣmRNA表达无显著变化。 3 0mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠmRNA表达均明显降低 ,而COXⅣmRNA表达无显著变化。结论 微波辐照下调大鼠大脑皮层和海马线粒体编码基因COXⅠmRNA表达 ,并存在剂量依赖关系 。

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)亚基Ⅲ基因(mtCOXⅢ)的相关信息设计引物,运用PCR技术,首次从亚洲黑熊四川亚种(以下简称四川黑熊,Ursus thibetanus mupinensis)的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列,并对其进行了初步分析.结果表明:四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp,ORF是783 bp,编码261个氨基酸的蛋白质,该蛋白的等电点为6.47,分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现,四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列的DNA微条形码技术鉴别11种生鲜肉制品掺假的研究

建立并优化了基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)序列的DNA微条形码(DNA mini-barcoding)技术,以检测生鲜肉制品中11种常见肉类的掺假情况。样品经真空冷冻干燥处理、提取DNA后,采用通用引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,目标条带扩增产物经切胶、回收、纯化后,进行克隆测序,并将测序结果提交到GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行Blast比对,筛选出适合猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鸽子肉、马肉、驴肉、鹅肉、兔肉、鼠肉等11种肉类扩增的通用引物COⅠ-A,并对PCR扩增条件进行优化,建立18个掺假模型,以对低经济价值肉类的最低掺入比例进行考察验证。结果表明:11种肉类的PCR扩增效率均为100%。在这18个掺假模型中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类(猪肉、鸡肉、鸭肉、马肉、驴肉、鼠肉)的最低检出比例均为5%,而在鹅肉、鸽子肉和兔肉中其最低检出比例为10%。本方法前处理简单,灵敏度高,重现性好,可作为高经济价值生鲜肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。

阿尔茨海默病患者血液细胞线粒体内细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因存在缺失

目的 调查 2 5例老年痴呆患者血细胞线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的突变情况 ,探讨线粒体DNA突变与阿尔茨海默病 (AD)性老年痴呆发生发展的关系。 方法 采用微量法提取血细胞总DNA直接作为PCR模板 ,进行巢式PCR扩增 ,最后采用DNA序列分析鉴定突变。 结果 在正常老人组 ,只扩增了 2 80bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因 (COX2 )扩增片段 ,而在老年痴呆患者中出现了 4 6 4bp和 2 80bp的多态性扩增片段 ,并且发现了 1个 32 0bp的新的线粒体DNA缺失片段 ,1位AD患者的COX2基因存在一种新的缺失后重组现象 ,COX2基因的 1条单链在np75 0 3处断裂 ,另 1条单链在np7785处断裂 ,这两个断裂的游离片段通过插入 1个额外的胞嘧啶核苷酸重新连接起来。 结论 老年痴呆患者中的COX2基因存在片段扩增多态性。

过表达OMA1通过促进线粒体释放细胞色素C诱导肺腺癌A549细胞凋亡

目的:探讨OMA1在肺腺癌中的表达水平及其对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制。方法:收集2018年01月至2019年10月在本院保存的42例经病理确诊为肺腺癌患者的癌组织样本及其癌旁组织(距离肿瘤边缘≥5 cm),免疫组化染色法检测癌组织及癌旁组织中OMA1表达情况。体外培养人肺腺癌细胞系NCI-H2009、Calu-3、SPC-A-1、A549及人正常肺上皮细胞BEAS-2B,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中OMA1 mRNA和蛋白表达水平。采用OMA1过表达慢病毒及其空载慢病毒感染A549细胞,分为OMA1过表达慢病毒感染组(OMA1组)和空载慢病毒感染组(Vector组),另设置空白对照组(Blank组)。采用MTT检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡水平;JC-10染色法检测细胞线粒体膜电位变化;qRT-PCR法检测细胞中OMA1 mRNA表达水平;Western blotting法检测细胞中OMA1、cleaved caspase-3、OPA1以及细胞线粒体和胞浆中Cyt C蛋白表达水平。结果:肺腺癌患者癌组织中OMA1表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)。NCI-H2009、Calu-3、SPC-A-1和A549细胞中OMA1 mRNA和蛋白表达水平显著低于BEAS-2B细胞(P<0.05)。与Blank组或Vector组比较,OMA1组细胞中OMA1 mRNA和蛋白表达水平、细胞凋亡率及cleaved caspase-3蛋白和胞浆中Cyt C蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而细胞增殖活性、线粒体膜电位及OPA1蛋白和线粒体中Cyt C蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论:OMA1在肺腺癌组织及其细胞系中低表达,过表达OMA1可通过下调OPA1蛋白表达、破坏线粒体膜电位、加速线粒体Cyt C释放而诱导肺腺癌A549细胞凋亡。

玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。

基于部分线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mtCOI)DNA序列的6种蝙蝠(翼手目:蝙蝠科)的分子系统进化关系

对贵州5种蝙蝠科蝙蝠的部分线粒体细胞色素氧化酶亚基ⅠDNA序列进行了测定,并结合从Genbank获得的爪哇伏翼的相应序列,以Pteropus dasymallus,P.scapulatus,Rousettus aegyptiacus为外群,运用贝叶斯法(Bayes-ian),最大似然法(Maximum Likelihood,ML)分析了这6种蝙蝠科蝙蝠的分子系统进化关系。结果表明:在贝叶斯,ML树中,这6种蝙蝠科的蝙蝠可分为3个分支:亚洲长翼蝠是第1个独立出来的分支;白腹管鼻蝠是继亚洲长翼蝠之后第2个分离出来的分支;第3个分支又分为两支,一支由大鼠耳蝠和小鼠耳蝠组成,另一支由南蝠和爪哇伏翼组成,支持将这4种蝙蝠同归于蝙蝠亚科的结论,从一定程度上否定了鼠耳蝠属和管鼻蝠亚科之间的姐妹类群关系,也不支持将鼠耳属提升为亚科。

日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的克隆与初步分析

目的:了解日本血吸虫湖北株细胞色素C氧化酶亚基(mt co)基因的生物学特性.方法:以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物应用降落PCR扩增、纯化基因片段后连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆、测序并与NCBI数据库中的核酸序列进行同源性比对分析,利用蛋白质分析软件分析该序列编码蛋白的相关生物学特性.结果:克隆序列的结果表明co基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸;编码蛋白的等电点为6.28,相对分子量为59 KDα,具有一个细胞色素C氧化酶亚基的核心保守结构域.结论:日本血吸虫湖北株co基因与其他地理株具有较高的同源性.

蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基Ⅲ的序列及其分子进化分析

测定了蓖麻蚕Samiacynthiaricini线粒体基因组 (mtDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ (COX3)、tRNA Gly和部分的NADH亚基Ⅲ (ND3)基因的DNA片段序列。COX3基因编码框包含 789个核苷酸 ,编码 2 6 2个氨基酸的蛋白质。通过同源性比较 ,发现COX3基因的 3′端比 5′端要保守 ,其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在。COX3的下游为 6 6bp的tRNA Gly基因。蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是 80 2 %和 85 6 %。根据COX3氨基酸序列进行了 12种无脊椎动物的分子进化树分析 ,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时 ,应该综合考虑物种的繁殖模式及生态特点。

过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究

目的 探讨过氧化氢 (H2 O2 )导致线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素C氧化酶 (COX)基因损伤(突变 )后对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系。方法 采用生物信息学技术 ,运用计算机同源模建的方法模拟人天然COX亚单位和其突变体的空间结构 ,并利用已有的实验数据 ,结合模建的结果进行了结构、功能的分析、研究。结果 在COXⅠ的三维结构中突变的部位 (残基 2 97～ 30 6 )位于分子的最外部 ,而该区域参与了与B亚基 (相当于COXⅡ亚基 )的作用 ,该部位的突变使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化 ,导致附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特性出现变化 ,这些变化对酶复合物的形成有直接的影响 ;COXⅡ突变后 ,组成分子结构的“椅靠”部分和“椅面”部分之间的夹角略有增大 ,而“椅靠”和“椅面”之间的夹角的变化将会影响整个酶分子的稳定性。结论 H2 O2 导致的mtDNA编码COXⅠ、COXⅡ亚基基因突变使其编码的COX蛋白空间结构发生改变 ,这种改变是其功能改变 (如酶蛋白活性下降 )的主要原因。

基于线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)序列的猪和兔四个疥螨分离株的系统发育关系分析

为了探讨兔疥螨分离株和猪疥螨分离株的分类地位,采用PCR技术首次扩增了分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427bp,序列间无插入、缺失,A+T含量(73%)明显高于G+C含量(27%),碱基组成存在明显偏移。猪和兔的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高(99.1%～100.0%),它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%～99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的:通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。方法:根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,插入到pENTR/U6质粒缺口末端,连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体;通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest载体上,构建含U6启动子、靶序列和PolⅢ终止子表达框的MTCOX-IshRNA表达重组体;经脂质体导入293FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度。Westernblotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结果:将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒。Westernblotting检测结果证实构建的MTCOX-IshRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结论:成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。

血吸虫细胞色素C氧化酶亚基I基因的克隆与近缘种属关系分析

从生物化学的角度比较血吸虫不同虫株的遗传进化差异.以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物扩增获取血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶基因片段,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序,对克隆得到的coⅠ基因作进化分析.结果表明:无论是在核苷酸序列还是在氨基酸序列上,日本血吸虫湖北株与其近地域株(云南、江苏、湖南)均具有较高的同源性,coⅠ基因的相似性分别为98%、98%和97%,但与不同种属血吸虫(曼氏、湄公、埃及、马来)的一致性则较低,分别为76%、84%、76%、85%,由此证实日本血吸虫湖北株与其它近地域株具有较近的亲缘关系.

核因子κB亚基65及细胞色素C氧化酶-Ⅱ在大鼠急性肝衰竭模型中的变化及意义

目的观察核因子κB亚基65(nuclear factor-κB,NF-κB p65)及细胞色素C氧化酶-Ⅱ(cytochrom eCoxidase-Ⅱ,COX-Ⅱ)在大鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)模型中的变化。方法 Sprague-Dawley雄性大鼠40只随机分为5组:对照组、ALF4h组、ALF8h组、ALF12h组和ALF24h组。ALF组采用D-氨基半乳糖(800mg/kg)和脂多糖(100g/kg)联合腹腔注射构建ALF模型,对照组注射同等体积的0.9%氯化钠溶液。分别检测各组的ALT、AST、TBIL、ALB、PT、PTA及观察各时间点肝脏病理变化;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏内NF-κBp65的mRNA水平,分光光度法检测各组大鼠肝脏线粒体中的COX-Ⅱ活性。结果光镜结果显示,ALF8h组可见明显肝细胞凋亡,而12h组和24h组可见明显肝细胞坏死。ALF组中8h、12h及24h肝脏NF-κBp65的mRNA水平明显低于对照组(P均<0.001),24h最低。COX-Ⅱ的活性在ALF4h开始升高,8h达到高峰(与对照组比较,P=0.008),12h开始下降,24h下降更为明显。结论 ALF大鼠肝脏NF-κBp65的mRNA水平降低,肝脏线粒体COX-Ⅱ活性在凋亡阶段升高,后期降低。二者均参与了ALF中肝细胞凋亡的发生,同时NF-κBp65还可能抑制了ALF过程中肝细胞的再生。

布氏田鼠肝脏内线粒体蛋白含量及细胞色素c氧化酶活性的变化

为探讨线粒体能量代谢中细胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase,CcO)在布氏田鼠(Microtusbrandti)生长发育过程中的作用,应用紫外分光光度法测定了不同日龄的幼鼠肝脏内线粒体蛋白含量及CcO活性。结果发现根据幼鼠肝脏内线粒体蛋白的含量可将生长发育大致分为3个阶段:1～3日龄,4～19日龄,20日龄至成体。CcO活性变化趋势则呈倒钟形,以17日龄的CcO活性为最高。据此推测布氏田鼠肝脏内CcO的活性可能与恒温机制的建立有关系。

羊驼细胞色素C氧化酶VIc亚基基因序列的测定与分析

本研究通过克隆分析羊驼细胞色素c氧化酶VIc亚基基因的序列，对羊驼细胞色素c氧化酶的VIc亚基基因的结构和功能进行了初步探索。实验利用免疫印迹技术（Southern blotting）对已有羊驼皮肤cDNA文库进行筛选并测序，结果表明该基因大小为424bp，含一个完整的ORF，位于36～266bp，编码77个氨基酸。对该基因序列分析表明：该基因编码的蛋白质含有疏水性区域、一个跨膜区并具有信号肽。同源性分析表明，核苷酸序列同源性为76％～100％。

郑州地区4种尸食性苍蝇线粒体DNA中细胞色素氧化酶亚基基因序列检测

目的:通过检测尸食性苍蝇线粒体DNA(mtDNA)中细胞色素氧化酶亚基(COⅠ)中305bp基因序列,鉴定尸食性苍蝇的种类,解决依据形态学不能鉴定苍蝇幼虫种类的难题。方法:随机采集郑州市区、郊区等不同放置地点的实验动物尸体上的2科4种共17个苍蝇的成虫、蛹、卵为样本,提取上述样本的mtDNA进行PCR扩增,产物检测与纯化、正反双向测序,并使用相关软件进行序列拼接、比对及进化距离分析,并构建种内和种间的系统发育树。结果:种内进化分歧均数小于1%,种间进化分歧均数大于1%,具有统计学意义。结论:尸食性苍蝇mtD-NA中COⅠ序列分析能有效地对尸食性苍蝇的种类进行鉴定,该方法简便、快捷、准确,可作为法医鉴别尸食性苍蝇种类的可靠依据。

益气活血中药复方对CVB_3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ表达的影响

目的:研究益气活血中药复方调控CVB3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochromeC oxidase subunitⅠ)及细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome C oxidase subunitⅡ)表达的作用机制。方法:本实验用Wistar大鼠心肌细胞建立柯萨奇病毒B3(CVB3)感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆受CVB3攻击的宿主细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因。结果:细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ在中药组中呈高表达,病毒组中表达减弱或被抑制。结论:益气活血中药复方能够影响受CVB3攻击的宿主细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ的表达,有效保护心肌,阻断病程进度,实现治疗病毒性心肌炎的目的。