胸腺细胞和细胞器水平的线粒体膜电势研究

以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡；利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡；利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化：抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况。实验结果显示,DEX显著诱导胸腺细胞早期和晚期凋亡,凋亡细胞主要来自G_0/G_1期；细胞水平可见DEX介导与△ψm相关的J-aggregate和DiOC_6(3)可染性降低,同时介导线粒体数量显著降低,6h细胞膜完整性无显著变化：单纯线粒体检测结果显示,多数线粒体维持正常△ψm。提示,DEX介导胸腺细胞凋亡中线粒体数量降低,现存线粒体多保持着正常△ψm以维持凋亡过程细胞能量供给。

凋亡细胞线粒体膜电势与物理参数变化的可视化研究

目的:通过放线菌酮(CHX)诱导HL-60细胞凋亡模型,探讨线粒体膜电势与细胞物理参数的变化。方法:建立CHX诱导HL-60细胞凋亡模型。于6和18 h时点,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡和晚期凋亡细胞及坏死细胞比率;利用JC-1染色流式细胞术,通过对对照组和CHX组FL1/FL2散点图上具有不同荧光强度的细胞群划分为R2,R3,R4 3个细胞群,并分别对这些细胞群在FSC/SSC二维散点图上进行反向设门,分析细胞凋亡过程中线粒体膜电势变化与细胞物理参数间的关系。通过透射电镜观察凋亡细胞形态结构改变。结果:CHX可引起HL-60细胞凋亡;与对照组相比,CHX组R2和R3细胞群物理参数为FSC和SSC均显著增高,但线粒体膜电势无显著性差异,P>0.05;R4细胞群则为FSC降低,SSC增高,P<0.05,且线粒体膜电势降低。CHX可诱导HL-60细胞体积变小,皱缩,并出现凋亡特征,如核固缩形成新月体和质膜"出芽"现象。结论:流式细胞仪FSC/SSC图可视为细胞指纹图谱。本模型中线粒体膜电势降低的细胞变小,且颗粒程度增加,可能与细胞凋亡过程中的结构改变有关。

缺氧对肾癌细胞STC1、HIF-1α及线粒体膜电势稳定影响的研究

目的检测缺氧条件下肾癌细胞斯钙素蛋白1(STC1)及线粒体膜电势稳定指标的变化,结合细胞增殖和Ca2+水平,初步探讨肾癌细胞可能的抗乏氧机制。方法分别使用50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的CoCl2干预细胞培养基构建化学性缺氧模型;MTT法检测细胞生长情况,荧光分光光度法检测细胞内Ca2+水平和线粒体膜电位(ΔΨm),紫外分光光度计测MPTP,RT-PCR检测STC1、HIF-1α的基因表达情况。结果与对照组相比,缺氧能显著抑制细胞增殖,促进细胞内Ca2+水平上升(P<0.05);缺氧可使MPTP开放度增加、?Ψm减低(P<0.05),且此时细胞内STC1、HIF-1α的基因表达升高(P<0.05);以上变化均随着缺氧程度的加剧而逐渐增大。结论缺氧条件下STC1、HIF-1α对Ca2+的负调控可能有利于肾癌细胞线粒体膜电势稳定,对肾癌细胞起保护作用。

CLIC4-RNAi对H_2O_2诱导的U251损伤细胞中线粒体膜电势的影响

作为细胞内氯通道家族成员之一的细胞内氯通道4（CLIC4）也称之线粒体细胞内氯通道（mtCLIC）,是细胞内氯通道家族中唯一在线粒体上表达的氯通道,最近大量研究表明CLIC4也参与了细胞凋亡过程。本实验通过过氧化氢（H2O2）复制神经胶质瘤（U251）细胞损伤模型,检测线粒体膜电势的改变,探讨CLIC4-RNAi对H2O2诱导的U251损伤细胞的线粒体膜电势的影响及其相关机制。

阿片类药物长期作用对μ-中国仓鼠卵细胞基因表达的影响及与PC12细胞线粒体膜电势之间的关系

目的 从基因水平入手，筛选 DAMGO长期作用后μ-中国仓鼠卵细胞 (μ- CHO)差异表达的基因，初步研究阿片类药物与 PC12细胞线粒体膜电势之间的关系。方法 选用μ受体特异性激动剂 DAMGO长期（ 72 h）作用于μ- CHO细胞，模拟耐受成瘾。利用差异显示 PCR、克隆、 Northern印迹分析等找出表达水平有改变的基因，测序，并与 NIH Blast数据库中序列比对。利用激光共聚焦显微成像、线粒体膜电势测定等方法，观察吗啡短期与长期作用 PC12细胞线粒体膜电势的变化。结果其中一条基因在用 DAMGO长期刺激μ- CHO细胞后基因水平出现上调，并与大鼠线粒体膜上 H＋ /磷酸基同向转运蛋白编码基因同源性很高。线粒体膜电势测定发现，用 10－ 6～ 10－ 4 mol/L吗啡短时间（ 2 h）作用 PC12细胞后，细胞内线粒体膜电势部分丧失或完全丧失；长时间（ 12～ 60 h）作用后，膜电势出现从部分丧失、完全丧失到逐步恢复的现象，上述现象均能被阿片受体拮抗剂纳洛酮阻断。结论 初步提示阿片类药物长期作用含有阿片受体的细胞后，可导致细胞线粒体功能改变，推测阿片类药物可能影响细胞线粒体电子转移、 ATP合成过程，此过程可能与阿片类药物长期激活阿片受体导致的成瘾、耐受有关。

定位在线粒体的肝刺激因子对线粒体膜电势的影响

目的肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)可以保护肝细胞免受各种毒素的影响,但机制尚未清楚,研究探讨肝刺激因子保护肝细胞的可能机制。方法利用稳定转染FLAG-pcDNA 3.0/hHSS的肝癌细胞BEL-7402为模型,使用Alexa Flour 488、Hoechst 33342、MitoTracker 580分别将HSS、细胞核以及线粒体染色,观察HSS在细胞中的定位情况。当野生型7402细胞、转染空载体FLAG-pcDNA 3.0的7402细胞以及转染FLAG-pcDNA 3.0/hHSS的7402细胞受到线粒体膜孔道开放剂羰基氰化间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)的损伤后,用电镜观察线粒体形态、荧光素酶检测ATP、流式细胞仪测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)等,综合观察过表达HSS的肝细胞的抗损伤能力。结果在稳定转染hHSS基因的7402细胞中,大部分HSS与线粒体共定位;在CCCP作用下,对照组野生型7402细胞以及转染空载体的7402细胞MMP下降明显,线粒体肿胀,嵴断裂、消失,ATP下降显著;实验组稳定转染hHSS基因的7402细胞MMP下降幅度较小,线粒体肿胀与嵴形态的改变明显减轻,ATP的含量较对照组高。结论肝刺激因子HSS在细胞中主要定位于线粒体,可以稳定MMP,维持线粒体形态及细胞内ATP的水平,从而增强肝细胞抗损伤的能力。

MK-801对围生期缺氧缺血性损伤后脑细胞线粒体膜电势的影响

目的了解围生期缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后脑细胞线粒体膜电势(△Ψm)的变化及NMDA型谷氨酸受体拮抗剂MK-801对这一变化的影响。方法应用7日龄新生SD大鼠HIBD动物模型,将实验动物分为正常对照组(n=6),HIBD组(n=10)和HIBD+MK-801组(n=10)(MK-801于低氧处理前按0.3mg/kg剂量腹腔注射)。于缺氧缺血后立即断头处死动物,制成脑细胞悬液后,以罗丹明123(Rho123)标记、以流式细胞仪测定△Ψm的变化。结果围产期HIBD时双侧脑细胞△Ψm值均显著降低,差异具有显著性(P<0.05),以损伤侧(右侧)为甚,右侧脑细胞△Ψm由正常状态下的(18.93±0.74)MFL降至损伤后的(7.59±0.32)MFL,右:左△Ψm比值由正常状态下的1.06±0.05降至损伤后的0.80±0.06(降低了24.5%),差异具有显著性(P<0.05)。结论HIBD后脑细胞△Ψm明显降低,提示线粒体功能明显受损;MK-801可减轻这一变化,提示NMDA型谷氨酸受体拮抗剂可通过减轻线粒体功能受损程度治疗围产期缺氧缺血性脑损伤。

益气通络颗粒对原代皮层神经元细胞活力、毒性及线粒体膜电势的影响

目的探讨益气通络颗粒治疗中风的可能作用机制。方法将孕18天左右的大鼠麻醉后取出胎鼠,提取原代皮层神经元细胞,分为空白对照组、模型组及益气通络颗粒高、中、低剂量组(分别加药100、50及25mg/ml,加药体积为100μl),每组5孔。除空白对照组外,其余各组均进行氧糖剥夺处理。氧糖剥夺3h、复氧24h后,观察各组神经元的细胞活力、细胞毒性、线粒体膜电势(JC-1)、活性氧簇(ROS)及三磷酸腺苷(ATP)表达。结果与空白对照组比较,模型组细胞活力、线粒体膜电势、ATP含量明显下降,细胞毒性、ROS含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,益气通络颗粒高、中剂量组细胞活力、线粒体膜电势、ATP含量明显上升,细胞毒性、ROS含量显著下降,益气通络颗粒低剂量组细胞毒性亦显著下降(P<0.05或P<0.01)。与益气通络颗粒低剂量组比较,益气通络颗粒高、中剂量组细胞毒性、ROS含量下降,线粒体膜电势、ATP含量均升高,益气通络颗粒高剂量组细胞活力上升(P<0.05或P<0.01)。与益气通络颗粒中剂量组比较,益气通络颗粒高剂量组细胞活力升高,ROS含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论益气通络颗粒能够显著提高缺氧神经元的细胞活力,其机制可能是通过调节ROS和ATP的生成,降低线粒体损伤。

新生SD大鼠缺氧缺血性脑损伤早期线粒体内膜跨膜电势的变化

【目的】 了解缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)早期脑细胞△Ψm的变化。 【方法】 7日龄新生大鼠随机分为正常对照组 (n =6) ,HIBD组 (n =3 6,分为HIBD后 0、1、2、3、4h时间点组 )。予以右颈总动脉分离结扎后再置8%O2 低氧舱 2 .5h ;断头处死后分离左右大脑半球制成单细胞悬液 ,加入终浓度为 1μmol的罗丹明 12 3于 3 7℃避光孵育 45min后 ,以流式细胞仪测定△Ψm并计算左右大脑半球△Ψm比值。 【结果】 正常P7SD大鼠左、右侧大脑半球脑细胞△Ψm分别为 ( 18.2 1± 1.2 6)MFL和 ( 18.93± 0 .74)MFL ,右∶左比值为 1.0 6。HIBD损伤使双侧大脑半球脑细胞△Ψm降低程度更明显 ,其中HIBD后 0h时△Ψm右∶左比值比正常时降低了 2 4.5 %(P <0 .0 5 )。HIBD后 1～ 3h时间内 ,△Ψm稍有回升。HIBD后 4h时HI损伤侧△Ψm值及右∶左比值均出现第二次降低现象 ,且程度更重 ,其中右 :左比值比正常时降低了 3 4%(P <0 .0 5 )。 【结论】 HIBD早期脑细胞△Ψm出现两次降低 (初次及二次降低 ) ,分别发生在HI损伤 0h和 4h时 。

α-突触核蛋白通过氨基端引起MN9D细胞线粒体膜损伤

目的在MN9D细胞中,探讨α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)氨基端(α-syn/N),NAC区,及C端(α-syn/C)对细胞及线粒体的作用。方法将细胞分为未处理组(control),空载体组(Myc),α-syn过表达组(α-syn),α-syn/N过表达组(α-syn/N),α-syn/del N过表达组(α-syn/del N),α-syn/NAC过表达组(α-syn/NAC),α-syn/C过表达组(α-syn/C),α-syn/del C过表达组(α-syn/del C)并瞬时转染α-syn各结构域48 h。用MTT和LDH法检测过表达α-syn各个结构域对细胞活力及LDH释放情况的影响,通过共聚焦显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS水平,线粒体渗透性转运孔(m PTP)的开放情况及线粒体膜电势(ΔΨm)变化,用免疫荧光染色检测线粒体形态。结果过表达α-syn,α-syn/N,α-syn/del C能使细胞活力下降(P<0.01),LDH的释放量明显增加(P<0.01),细胞内活性氧(ROS)水平增加(P<0.001),线粒体渗透性转运孔(m PTP)异常开放增加(P<0.01),线粒体膜电势下降(P<0.01)。并且过表达α-syn/N后,55%的线粒体出现气球样改变。结论α-syn通过其氨基端引起线粒体膜损伤。

原子力显微镜检测α-突触核蛋白转基因鼠线粒体微观结构的变化

目的使用原子力显微镜检测α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)转基因小鼠模型中,皮质线粒体表面微观结构的变化。方法提取野生型和转基因小鼠皮质细胞线粒体,使用共聚焦显微镜检测其膜电势变化,使用原子力显微镜的敲击模式检测线粒体膜表面的微观结构。结果 JC-1染色法检测线粒体膜电势结果显示,转基因小鼠线粒体膜电势与野生组相比降低20.4%,差异有统计学意义(P<0.01);原子力显微镜观察结果显示,转基因小鼠线粒体长度与野生组相比增加,表面光滑度减低,线粒体膜孔增多(P<0.05)。结论α-Syn的转基因小鼠线粒体膜电势减低,线粒体膜完整性受到破坏。在原子力显微镜敲击模式下检测离体线粒体,能反映出转基因小鼠线粒体膜表面微观结构的变化。

白藜芦醇抑制HIF-1α对肾癌细胞线粒体功能及抗乏氧增殖的调控

目的:观察白藜芦醇(Res)抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对肾癌细胞内钙离子、线粒体功能的影响,探讨其在肾癌细胞抗乏氧增殖过程中的可能机制。方法:将人肾癌GRC-1细胞分为正常组和缺氧组,正常组细胞在常氧条件下培养,缺氧组用150μmol/L二氯化钴干预GRC-1细胞48 h构建缺氧肾癌细胞模型。两组各给予不同浓度(0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L)的Res进行干预。采用MTT法检测细胞活力,分别采用RT-qPCR、酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测细胞内HIF-1α基因和蛋白表达,分光光度计检测细胞内钙离子水平及线粒体膜电位(ΔΨm)、线粒体通透性转换孔(mPTP)开放程度。结果:随着Res浓度的增加,两组细胞活力、HIF-1α基因及蛋白表达量均逐渐降低,缺氧组显著高于正常组,缺氧组细胞活力下降趋势明显缓于正常组(均P<0.05)。两组细胞内钙离子含量和mPTP开放程度均随Res浓度的增加而逐渐升高,Δѱm逐渐降低,且缺氧组细胞内钙离子含量和mPTP开放程度显著高于正常组,Δѱm明显低于正常组(均P<0.05)。结论:Res可能通过增加细胞内钙离子含量,促进mPTP开放,降低ΔΨm,使线粒体解偶联功能受损,从而抑制细胞增殖,但该抑制作用随着Res对HIF-1α的进行性抑制而逐渐减弱,该作用可能参与了肾癌细胞的抗乏氧增殖机制。

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11.8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2.5倍,达1.190 mg/g.dry.wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6.7%。

甘草查尔酮B体外细胞毒作用研究

为考察甘草查尔酮B(Licochalcone B)对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用,初步探讨其作用机制,本研究采用MTT染色法检测甘草查尔酮B对5种肿瘤细胞人乳腺癌细胞(MCF-7)、人膀胱移行细胞癌细胞(T24)、人宫颈癌细胞(HeLa)、高转移性小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F0)的增殖抑制作用;台盼蓝拒染法测定甘草查尔酮B对B16F0细胞的致死率;相差显微镜观察细胞形态;JC-1染色测定线粒体膜电势(△Ψm)。结果表明:甘草查尔酮B(5、7.5、10、12.5、15μg/mL)可浓度依赖性地抑制5种不同肿瘤细胞的增殖,在最高浓度时,抑制率分别为67.52%、67.24%、65.41%、62.81%、68.13%;随甘草查尔酮B处理浓度的增加,B16F0细胞死亡率升高,细胞皱缩,脱落细胞增多;甘草查尔酮B可明显降低B16F0细胞的线粒体膜电势,且呈现浓度依赖性。以上结果显示:甘草查尔酮B对多种肿瘤细胞体外增殖均有明显的抑制作用,这可能与其所致的线粒体损害有关。

A549/DDP细胞的抗凋亡特性与其pH_i和[Ca^(2+)]_i变化相关

以临床用药剂量 (30 μmol/L)的顺铂处理敏感的人肺腺癌细胞A5 49和抗顺铂的A5 49/DDP细胞 ,在相同条件下培养 .对培养不同时间的两株细胞DNA琼脂糖凝胶电泳分析的结果表明 ,前者在培养 12h后即呈现DNA梯子 ,而后者在培养 48h后却未见凋亡特征 .用流式细胞计检测其凋亡峰也获得相似的结果 .当测定与凋亡相关的生物化学和生物物理变化时发现对顺铂敏感的A5 49细胞的线粒体膜电势显著降低 ,胞内更加酸化且胞内钙离子浓度升高 ;而抗顺铂药物的A5 49/DDP细胞的线粒体膜电势和pH值却维持在相对较高的水平 ,而其胞内钙离子浓度随培养时间的延长下降 .这些结果表明 ,抗顺铂的人肺腺癌A5 49/DDP细胞的抗凋亡特性与其胞内的相对碱化和较高的线粒体膜电势 ,以及胞内钙离子浓度的降低相关 .这些特性可能参与了A5

RGS蛋白对阿片受体-腺苷酸环化酶的调节及阿片受体对钾通道调节的研究进展

本文介绍了RGS蛋白对阿片受体-腺苷酸环化酶活性的调节;阿片受体长期激活对细胞内钙离子、细胞浆酸碱度以及线粒体膜电势的影响;以及阿片受体不通过G蛋白对细胞膜外向整流钾通道的调节机理。

漆黄素对淋巴细胞和巨噬细胞分泌NO的免疫调节作用(英文)

目的探讨漆黄素(fisetin)在体外对小鼠T淋巴细胞增殖、活化、凋亡、ROS的释放和巨噬细胞NO释放功能的影响。方法 CFDA-SE标记技术结合流式细胞术检测漆黄素对T淋巴细胞增殖及增殖指数(PI)的影响。荧光抗体染色结合流式细胞术分析漆黄素对T淋巴细胞在Con A的刺激下CD25的表达水平的影响。DIOC染色检测细胞线粒体膜电势的变化情况,H2DCFDA染色检测细胞ROS释放的变化。Griess试剂盒用以检测巨噬细胞NO释放功能。结果漆黄素(2.5,5和10μmol/L)明显抑制T淋巴细胞增殖,增殖指数(PI)降低并具有剂量依赖性。漆黄素可明显抑制CD25的表达(P<0.01)及ROS的释放。DiOC6(3)染色分析显示,漆黄素可促进细胞的凋亡。巨噬细胞在LPS和IFN-γ的刺激下的NO释放量明显增加,而在漆黄素作用下NO释放量明显下降(P<0.01)。结论漆黄素是一种潜在的免疫调节剂。

洋川芎内酯Ⅰ对氧糖剥夺/复氧大鼠原代大脑皮层神经元的影响

目的:研究洋川芎内酯Ⅰ(SENⅠ)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)大鼠原代大脑皮层神经元的保护作用,并探讨其相关的作用机制。方法:提取胎鼠原代大脑皮层神经元,预给药后进行OGD/R实验,分别评价细胞活力、细胞毒性,线粒体膜电势,ROS以及ATP生成的变化,并在此基础上探讨SENⅠ对cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)通路的调控作用。结果:与模型组比较,SENⅠ50、100μmol/L组OGD神经元的细胞活力显著提高(P<0.01),SENⅠ25、50、100μmol/L组细胞毒性显著降低(P<0.01)。SENⅠ50、100μmol/L组OGD神经元线粒体膜电势水平及ATP水平显著升高(P<0.01),SENⅠ100μmol/L组ROS水平显著降低(P<0.05);SENⅠ100μmol/L组CREB的磷酸化水平显著升高(P<0.05)。结论:SENⅠ增加了OGD原代大脑皮层神经元的线粒体膜电势,调控了ROS和ATP的生成,保护OGD原代大脑皮层神经元,其可能的机制是通过激活CREB而发挥保护作用。

一轮复习中新教材与新高考对接策略

在一轮复习中,基于新高考形式新旧教材部分知识呈现形式不同,教师和学生可能会在教学和学习过程中产生困扰,让学生对新旧教材知识运用感到力不从心,教师对相关新旧教材冲突的题目感到无所适从,笔者通过对比高中生物必修1新旧教材的几个方面,总结出一轮复习中新旧教材把握与新高考对接及相关备考策略与建议。