Bmal1对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其相关机制

目的探讨Bmal1对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其相关机制。方法选择健康雄性清洁级SD大鼠65只,采用数字表法随机纳入非糖尿病假手术组(N-S组)10只、非糖尿病缺血再灌注组(N-I/R组)10只、非糖尿病+SR8278缺血再灌注组(NS-I/R组)10只;剩余35只采用高脂饲料喂养+腹腔注射链脲佐菌素方法制备2型糖尿病模型,取造模成功的大鼠30只,采用数字表法随机分为糖尿病假手术组(DM-S组)、糖尿病缺血再灌注组(DM-I/R组)、糖尿病+SR8278缺血再灌注组(DMS-I/R组),每组10只。6组大鼠按观察项目不同随机分为A、B亚组,每组5只。各组大鼠制备心肌缺血再灌注模型,其中N-S组和DM-S组仅模拟手术过程,不结扎前降支;NS-I/R组、DMS-I/R组大鼠于心肌缺血再灌注模型制备前7天开始腹腔注射孤儿核受体Rev-erbα拮抗剂SR8278(50 mg/kg),每天1次×7 d。心肌缺血再灌注模型成功后维持灌注24 h,取各组A亚组大鼠,分离出左心室行病理染色检查和心肌超微结构透射电镜观察,分离左心室后的心脏制备病理切片进行心肌梗死灶体积的测定;各组B亚组大鼠,取心尖区心肌组织行Western blot测定心肌Bmal1、Sirt3、Nlrp3及Bnip3蛋白的表达。结果(1)N-S组和DM-S组未见心肌梗死灶,N-I/R组、NS-I/R组、DM-I/R组、DMS-I/R组心肌梗死灶体积分别为(0.48±0.08)cm^(3)、(0.34±0.05)cm^(3)、(0.65±0.06)cm^(3)、(0.46±0.06)cm^(3)。与N-I/R组比较,NS-I/R组心肌梗死灶体积较小,DM-I/R组较大,差异均有统计学意义(P值均<0.05);与NS-I/R组比较,DM-I/R组、DMS-I/R组心肌梗死灶体积均较大,差异均有统计学意义(P值均<0.05);与DM-I/R组比较,DMS-I/R组心肌梗死灶体积较小,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)心肌组织病理检查:N-S组心肌组织结构完整,心肌细胞排列整齐、致密,细胞质染色均匀;DM-S组心肌纤维排列稍紊乱,细胞质有轻度的肿胀,可见轻度炎性细胞浸润;N-I/R组细胞形态不规则,心肌纤维排列紊乱或断裂,细胞质有不同程度的肿胀甚至破裂,胞核排列不齐、碎裂和溶解;DM-I/R组心肌病理损伤程度较N-I/R组更重,心肌纤维断裂,心肌细胞崩解,细胞核溶解,染色加深,可见大量炎细胞浸润。与N-I/R组和DM-I/R组相比,NS-I/R组和DMS-I/R组心肌细胞形态和心肌纤维排列有所恢复,炎性细胞浸润大大减少。(3)电子显微镜下心肌组织超微结构:N-S组线粒体形态及数量正常,未见自噬体;DM-S组较N-S组出现自噬小体;N-I/R组心肌细胞中正常线粒体数量减少,线粒体明显肿胀并含有大量自噬体,一些自噬体显示出封装未降解的线粒体结构和残留的细胞成分。与N-I/R组相比,NS-I/R组线粒体结构较完整,线粒体轻度肿胀,损伤较轻;DM-I/R组线粒体嵴结构异常,线粒体嵴分隔、肿胀和溶解,线粒体面积/周长比增加,线粒体自噬功能受损,自噬体增加。与DM-I/R组比较,DMS-I/R组肌纤维排列较为整齐,线粒体中结构异常的线粒体嵴减少,自噬体数量减少。(4)心肌组织Bmal1、Sirt3、Nlrp3及Bnip3蛋白表达水平。与N-S组比较,N-I/R组、NS-I/R组、DM-S组、DM-I/R组、DMS-I/R组Bmal1、Sirt3蛋白的表达呈下降趋势,Nlrp3、Bnip3蛋白的表达呈上升趋势,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与DM-S组比较,DM-I/R组Bmal1、Sirt3蛋白表达下调,Nlrp3、Bnip3蛋白表达上调;DMS-I/R组Nlrp3蛋白表达下调,Bnip3蛋白表达上调:差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与DM-I/R组比较,DMS-I/R组Bmal1、Sirt3、Bnip3蛋白表达上调,Nlrp3蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论Bmal1在大鼠糖尿病心肌缺血再灌注损伤中对心肌有保护作用,其保护机制可能与激活Sirt3途径诱导线粒体自噬和抑制炎性反应有关。