靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针检测人肝癌HepG2细胞线粒体ROS水平动态变化

目的通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针(mt-roGFP2荧光探针)检测人肝癌HepG2细胞(以下称HepG2细胞)线粒体活性氧(ROS)水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础。方法采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体并测序鉴定。将慢病毒载体pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro与包装质粒pVSVg、pRev和pGag-Pol共转染人肾上皮293T细胞,获得mt-roGFP2慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将制备好的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,通过荧光显微镜和Western blotting法鉴定观察HepG2细胞roGFP表达情况。将对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞(HepG2-mtroGFP2细胞)与Mito Tracker线粒体荧光探针共温育,采用激光共聚焦显微镜观察mt-roGFP2荧光探针的亚细胞定位。取对数生长期HepG2-mt-roGFP2细胞先后经0.5 mmol/L过氧化氢(H_2O_2)和1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)处理,采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄同一细胞,Image J软件分析荧光图片。结果成功构建p LentiCMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体。制备的mt-roGFP2慢病毒平均滴度为4.04×10~8 IU/mL。mt-roGFP2荧光探针稳定表达在HepG2细胞中,并正确靶向HepG2细胞线粒体,成功构建HepG2-mt-roGFP2细胞。外源性氧化剂H_2O_2的加入可导致HepG2-mt-roGFP2细胞线粒体ROS水平明显升高,其荧光比值(405 nm/488 nm)从1.19上升到3.98,加入还原剂DTT可使其荧光比值下降至1.25。结论靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针能够实时动态、可逆地检测HepG2细胞线粒体ROS水平变化并实时成像。

线粒体示踪体系的建立及验证

目的通过构建稳定表达线粒体荧光报告系统的牙髓干细胞(DPSC)建立线粒体示踪体系,并采用该示踪体系研究间充质干细胞(MSC)向辐射损伤细胞输送线粒体。方法①构建质粒pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2(简称COX8A-DsRed2),并进行基因测序和PCR鉴定;COX8A-DsRed2用293T细胞包装获得慢病毒(Lv-COX8A-DsRed2)并感染DPSC,采用荧光显微镜观测红色荧光蛋白DsRed2在DPSC线粒体的稳定表达(DPSC-COX8A-DsRed2)。②在DPSC-COX8A-DsRed2中使用荧光染色法观察DsRed2荧光蛋白与线粒体膜受体线粒体外膜转位酶20(TOMM20)和线粒体示踪试剂MitoTracker Green的共定位。③采用10 Gy X射线照射大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6建立细胞辐射损伤模型,并使用5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光染料标记IEC-6细胞;于照射后,立即加入DPSCCOX8A-DsRed2,继续培养24 h,荧光显微镜观察DPSC-COX8A-DsRed2能否向辐照受损细胞递送线粒体。结果①载体成功插入基因COX8A和DsRed2基因序列,COX8A-DsRed2构建成功;DPSC-COX8ADsRed2细胞内表达红色荧光DsRed2;②荧光染色法结果显示,红色荧光报告系统DPSC-COX8ADsRed2与线粒体膜受体TOMM20、线粒体示踪试剂MitoTracker Green共定位于细胞线粒体;③DPSCCOX8A-DsRed2与辐射损伤IEC-6细胞共培养,荧光显微镜可观测到绿色荧光的IEC-6细胞中出现DPSC来源的红色荧光标记的线粒体,表明DPSC与IEC-6之间发生了线粒体转移。结论构建的线粒体荧光探针能够准确指示线粒体的转移,为下一步研究间充质干细胞线粒体转移在辐射损伤救治中的作用提供了理想工具。